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近年来各种病毒频频爆发,例如2002年爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）,2009年爆发的甲型H1N1流感病毒,2012年爆发的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）,2019年爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）,这些病毒都具有较强的传染性和致病性,快速、准确、灵敏的病毒检测可极大地减少其对人类社会的危害。除此之外,癌症也是影响人类健康的重大疾病之一。研究发现,早期患者经及时治疗有可能痊愈;而中晚期患者较难治愈,并且复发率和转移率较高。因此早发现、早诊断、早治疗对癌症患者极为重要。常规的病原学检测方法有直接涂片镜检、分离培养与生化反应法、免疫学检测法、核酸检测法等。其中,核酸检测法直接检测核酸,低丰度的核酸经过扩增反应后,可以产生大量的扩增产物,从而使检测具有较高的准确性、灵敏性和特异性,是目前使用最多的检测技术之一。常见的核酸扩增方法有聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）、依赖核酸序列的扩增（NASBA）等。这些方法具有较高的灵敏度,但都需要耗时费力的引物设计和优化过程,增加了检测的周期和成本。并且靶向的核酸片段长度应不低于100个核苷酸,无法适用于检测含有20-25个核苷酸的microRNA（miRNA）,因此这些方法也缺乏通用性。此外,核酸扩增产物需要有配套的信号输出方法,辅助实现高效、灵敏、便携化的检测。常见的信号输出方法有荧光、电化学、比色、便携式护理诊断平台（POCT）装置等,其中POCT装置（如血糖仪）由于具有操作简单、仪器小型化、结果即时化、成本低等优点,在应对突发疫情和控制传染性病毒的传播方面可以发挥极大作用。目前,已经利用血糖仪实现了对核酸类靶标的检测。但这些检测中,蔗糖酶需提前表达和纯化,操作繁琐;且受磁球批次等因素影响,结果的重现性和稳定性不理想。因此迫切需要建立一种免标记、免分离的信号输出方法。本课题将从以下三个方面开展:1.首次提出了一种双发夹连接介导的等温扩增方法（DHLA）。引入了一种SplintR连接酶,它能以互补的DNA或者RNA为“桥梁”,高效地催化相邻的脱氧核糖核苷酸的连接,使单发夹结构（SHP）连接形成双发夹结构（DHP）,进而开启指数扩增反应,且无需更换引物即可实现新靶标的检测。以miRNA和病毒RNA片段作为模型靶标,发现DHLA适用于短至20个核苷酸长度的核酸检测,检测限低至aM水平,满足miRNA的临床检测需求。以HER2+乳腺癌中均过表达的miRNA-21和miRNA-10b作为两个模型靶标,验证基于DHLA的多元化检测的有效性。这种多元检测可以提供两种及以上miRNAs的表达量信息,从而辅助癌症早期诊断与治疗。此外,利用基于DHLA的“多探针策略”检测了 SARS-CoV-2——通过同时锚定长片段靶标的多个区域,极大地降低了 RNA降解而导致的假阴性风险。2.将DHLA升级为DHLApro。DHLA经过序列设计（包括信号探针、靶标长度和连接处碱基类型）和体系优化（包括杂交缓冲液和SplintR连接酶浓度）,其灵敏度提高了约2000倍,满足病原体的检测需求。将F:Q探针替换为与BL*片段杂交的F*:Q*探针。BL*仅在DHP开启指数放大反应后产生,极大的降低了背景信号出现的可能性,灵敏度从aM提高到zM水平。在此基础上,利用DHLApro检测了传染性极强的SARS-CoV-2奥密克戎变体和德尔塔变体,具有极高的灵敏度和通用性。此外,基于DHLApro成功地开展了 N个病原体合1筛选、双管双通道四联检测和单管三通道三联检测,最大限度地减少了初筛和多元分析的开发周期、开发成本和交叉干扰（引物与引物之间的）。3.利用合成生物学中的Toehold Switch元件实现便携化的信号输出。含有Toehold Switch元件的传感质粒可以可控地表达报告蛋白,从而实现对靶标的检测。以热稳定蔗糖转化酶（TmINV）代替原有的β-半乳糖苷酶（LacZ）作为报告蛋白,成功构建了报告基因为TmINV的传感质粒。TmINV催化底物蔗糖转化为葡萄糖,通过个人血糖仪（PGM）即可读取信号,实现了对靶标的便携化检测。此外,为了避免复杂的Toehold Switch元件设计,在靶标和Toehold Switch元件之间引入四通中转探针（由TP1和TP2组成）,靶标与四通中转探针杂交,而不是直接与Toehold Switch元件序列相互作用。这种转导方法可以将不同的靶标输入到同一个高性能的传感质粒中,大大减少了 Toehold Switch元件的设计难度和成本,极大地提高了检测的通用性。综上,本文建立了一种新型的核酸等温扩增方法,不仅能检测短至20个核苷酸长度的核酸,还可以实现多元分析、初筛、基因分型、突变检测,具有极好的通用性、灵敏性和灵活性。同时本文还成功地将四通中转探针与报告蛋白为TmINV的传感质粒偶联,构建了一种通用、便携、高效的信号输出方法。这大大减少了 Toehold Switch元件的设计难度和成本,且利用血糖仪即可进行信号输出,为便携式护理诊断平台（POCT）的发展提供了新思路。