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目的:Apelin是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,在心血管系统形成及相关疾病的发生发展中具有重要作用。本实验室前期研究结果发现,apelin-13具有诱导心肌细胞肥大的作用,且自噬途径参与了apelin-13诱导的心肌细胞肥大过程。铁自噬(Ferritinophagy)是最新发现的一种调节细胞内铁代谢的选择性自噬。过度激活铁自噬可能诱导细胞内铁超载从而参与心肌肥厚的发展。本课题拟研究apelin-13对铁自噬及线粒体铁代谢的影响,并在前期研究的基础上探讨铁自噬-线粒体铁离子转运蛋白Sideroflexin1(SFXN1)依赖性线粒体铁超载介导apelin-13促心肌细胞肥大的新机制,揭示apelin-13/APJ系统诱导心肌肥厚的新的作用机制,为开发以APJ为靶点的抗心肌肥厚药物提供新的实验依据。方法:1、Western Blot:检测大鼠H9c2心肌细胞NCOA4,FTH1,SFXN1,TRC40,Tom7,Tom70,DMT1,BNP,LC3II/I的表达;2、分离线粒体并应用WB检测线粒体蛋白的表达;3、RNA干扰:设计RNA干扰链分别干扰H9c2心肌细胞中NCOA4,TRC40,Tom7,SFXN1的表达;4、普鲁士蓝染色法(Prussian blue staining)观察H9c2心肌细胞及心肌组织中铁沉积;5、钙黄绿素(calcein–am)荧光探针检测h9c2心肌细胞中游离铁的变化;6、流式细胞术检测h9c2心肌细胞中线粒体螯合铁的含量;7、rpa荧光探针观察h9c2心肌细胞中线粒体螯合铁的含量;8、mito-sox荧光探针检测h9c2细胞中线粒体ros的生成;9、免疫荧光观察ncoa4和lc3b共定位;10、sceptertm手持细胞计数器测量h9c2心肌细胞的直径和体积;11、bca试剂盒测定h9c2心肌细胞中的蛋白含量;12、免疫组化观察人尸检心肌肥厚心脏组织标本和双肾双夹大鼠肾血管性高血压模型大鼠心脏组织中apelin,bnp,ncoa4,sfxn1蛋白的表达;结果:1、apelin-13增加h9c2心肌细胞内游离铁含量,且进一步促进铁负载剂-枸橼酸铁(fac)诱导的游离铁的增加;apelin-13诱导h9c2心肌细胞内铁沉积,且进一步促进铁剂fac诱导的铁沉积;2、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)及时间(0-24h)依赖性抑制h9c2细胞中铁自噬底物铁蛋白(fth1)的表达,促进铁自噬货物受体ncoa4的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断apelin-13(0.1μmol/l,24h)对fth1和ncoa4的作用;apelin-13促进ncoa4与gfp-lc3b融合;自噬体降解抑制剂羟基氯喹(hcq)阻断了apelin-13对fth1的降解作用,进一步促进了apelin-13对ncoa4的表达;apelin-13进一步增强铁负载剂-枸橼酸铁(fac)诱导的铁自噬;3、ncoa4-sirna抑制apelin-13(0.1μmol/l,48h)诱导的h9c2心肌细胞内游离铁的增加;4、apelin-13(0.1μmol/l,48h)促进线粒体铁超载;apelin-13(0.1μmol/l,6h)促进线粒体ros增加;透射电子显微镜下观察到apelin-13(0.1μmol/l,12h)引起h9c2心肌细胞线粒体肿胀及空泡化;5、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)和时间(0-24h)依赖性促进h9c2心肌细胞中线粒体转铁蛋白sfxn1的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断了apelin-13(0.1μmol/l,24h)对sfxn1的作用;6、ncoa4-sirna抑制apelin-13诱导的sfxn1的表达;7、sfxn1-sirna抑制apelin-13诱导的线粒体铁超载以及线粒体ros的生成;8、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)以及时间(0-24h)依赖性促进h9c2心肌细胞中线粒体外膜转运酶tom7,tom70的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断了apelin-13(0.1μmol/l,24h)对tom7,tom70的诱导作用;apelin-13促进tom7锚定于线粒体;9、tom7-sirna抑制apelin-13诱导的sfxn1的表达;10、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)和时间(0-24h)依赖性促进h9c2细胞中尾锚蛋白识别因子trc40的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断了apelin-13(0.1μmol/l,24h)对trc40的作用;11、trc40-sirna抑制apelin-13诱导的tom7,sfxn1的表达;12、apelin-13促进铁离子转运体-二价金属离子转运体(dmt1)的表达,且被apj拮抗剂f13a抑制;13、Apelin-13促进H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加;apelin-13促进心肌肥大因子BNP的表达,且被F13A抑制;14、NCOA4-siRNA抑制apelin-13诱导的H9c2心肌细胞直径、体积增大以及心肌肥大因子BNP表达;SFXN1-siRNA抑制apelin-13诱导H9c2心肌细胞直径、体积增大以及心肌肥大因子BNP表达;Tom7-siRNA,TRC40-siRNA抑制apelin-13诱导的H9c2心肌细胞内心肌肥大因子BNP的表达;15、人尸检心肌肥厚心脏标本中BNP,apelin,NCOA4,SFXN1高表达;且出现铁沉积;16、双肾双夹肾血管性高血压模型大鼠心脏组织中BNP,apelin,NCOA4,SFXN1高表达;出现铁沉积。结论:铁自噬促Sideroflexin1(SFXN1)依赖性线粒体铁超载介导apelin-13诱导心肌细胞肥大