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1目的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是具有强烈诱导和促进血管形成作用的血管生长因了,该作用通过其与血管内皮生长因子受体(VEGF receptor, VEGFR)结合而介导。Ⅱ型VEGFR (VEGFR-2)又称为激酶功能区受体(kinase domain recepor, KDR),是介导VEGF在肿瘤新生血管形成发挥功能的主要受体。VEGF成熟肽链氨基端110个氨基酸残基多肽(VEGF110)是识别并结合VEGFR的区域,称为VEGFR结合肽(VEGFR binding peptide, VRB)。恶性肿瘤的生长和转移依赖于血管生成,VEGFR是肿瘤血管生成的特异性分子标志,因而成为抗血管生成治疗的主要靶分子。颗粒酶B(granzyme B, GraB)系淋巴细胞的细胞毒因子之一,是淋巴细胞发挥抗肿瘤、抗病毒作用的主要效应分子。GraB在穿孔素或其它破坏细胞膜的分子的协助下能通过细胞膜进入靶细胞内,激活多条信号传导途径诱导细胞凋亡根据恶性肿瘤血管生成的特点和机体细胞免疫的分子机制,有可能利用VRB的导向作用,使GraB靶向作用于肿瘤血管。我们曾分别克隆了人VRB基因cDNA片段和GraB基因cDNA,通过基因重组技术,构建了pBADA-VRB、 pBADA-GraB和pBADA-GraB-VRB表达载体。本实验中,我们将这些重组表达载体转化双歧杆菌(bifidobacteria),L-阿拉伯糖诱导表达重组蛋白,研究GraB-VRB融合蛋白能否作用于KDR阳性的血管内皮细胞和肿瘤细胞及其作用,为口服这种工程化双歧杆菌使之在肠道内表达重组GraB-VRB,靶向性地作用于新生血管内皮细胞,治疗有关肠道肿瘤提供一定的实验依据。2方法2.1细菌及细胞的培养双歧杆菌接种于MRS培养基中,37℃厌氧培养。各种细胞株均培养于含10%NCS的RPMI1640培养基中,置37℃,5%CO2培养箱中培养,2d换液传代1次。将细胞洗涤后供实验用,实验用细胞为状况良好的对数生长期细胞。2.2重组表达载体转化双歧杆菌采用电穿孔法。在电压2.5kV、电容25μF、电阻200Ω条件下,将3种重组表达载体分别转入双歧杆菌。将转化后双歧杆菌接种于含60μg/ml氨苄西林的MRS固体选择培养基,37℃厌氧培养。挑取乳白色、圆形边缘光滑完整的阳性菌落,接种于MRS液体培养基中,37℃厌氧培养。2.3重组蛋白的诱导表达为了将外源基因转化双歧杆菌的表达产物直接用于有关细胞实验中,重组蛋白的诱导表达在PRMI1640培养液(用丙酸调节pH值6.5左右)中进行。基因转化双歧杆菌接种于PRMI1640培养基后,37℃厌氧培养至OD650nm为0.6-1.0时,加终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱导表达培养24h。取样分离上清和菌体进行鉴定。小量分装培养上清,-70℃保存备用。2.4ELISA采用VEGF ELISA试剂盒测定培养上清中rhVRB的含量,以GraB ELISA试剂盒测定培养上清中rhGraB和rhGraB-VRB的含量,操作按ELISA试剂盒说明书进行。培养上清中重组蛋白的浓度,根据ELISA测定结果和各重组蛋白的计算分子质量折算为mol浓度。2.5免疫印迹分别取经L-阿拉伯糖诱导表达24h的转基因双歧杆菌菌体和培养上清,经样品处理液煮沸处理后,进行SDS-PAGE(12%凝胶);电泳完成后,将蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭过夜,加抗GraB单克隆抗体室温反应2h,洗涤后加相应的HRP-兔抗鼠Ig抗体室温反应2h,加入化学发光剂,放入暗盒中压片,2-5min后显影、定影。收取生长状态良好的各细胞株,离心洗涤后收集细胞,采用可溶性膜蛋白相位分离制备试剂盒制备各细胞株的粗提膜蛋白样品,操作按说明书进行。膜蛋白进行SDS-PAGE(10%凝胶),如上转膜和封闭后,加抗KDR/Flk-1单克隆抗体反应,余同上。2.6细胞增殖试验采用磺酰罗丹明B((Sulforhodamine B, SRB)法。收集生长状态良好的细胞,洗涤后重悬为适当密度的细胞悬液,加入96孔培养板,每孔105细胞,并加入含一定终浓度工程化双歧杆菌产物的培养上清,培养一定时间。在显微镜下观察、拍照保存资料。按照SRB细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书进行固定、染色、脱色,最后在酶联仪上测定OD515nm值。2.7TUNEL细胞凋亡原位检测收集脐带血管内皮细胞HUVEC,在培养板中每孔加入105细胞,加入含rhGraB-VRB培养上清至rhGraB-VRB终浓度为8nmol,培养24h,取细胞进行涂片。采用TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡原位检测试剂盒分析细胞凋亡,操作按照说明书进行。2.8统计学分析实验数据用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),多个样本均数间每两个均数的比较采用SNK法(g检验),两样本间用独立样本t检验。3结果3.1重组蛋白的表达工程化双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达培养24h,分离各上清,以ELISA方法检测重组蛋白rhVRB. rhGraB和rhGraB-VRB,发现有重组蛋白分泌表达,其含量大致在0.5M.0μg/ml。分离GraB-VRB基因转化双歧杆菌培养物的菌体和上清,进行免疫印迹鉴定,发现上清和菌体样本均在约38kD处出现蛋白条带,表明除上清中有rhGraB-VRB外,菌体内也存在rhGraB-VRB。3.2KDR/Flk-1在几种不同类型细胞中的表达将各细胞株的粗提膜蛋白样品,进行免疫印迹分析,发现人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC表达高水平的KDR/Flk-1,小鼠结肠癌细胞株CT-26也表达KDR/Flk-1,但水平较低,而另外几个细胞株包括人结肠癌细胞株SW480、人Burkitt’s淋巴瘤细胞株Raji和小鼠成纤维细胞株NIH3T3则否。3.3rhGraB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞生长在细胞中加入不同终浓度的各种重组蛋白处理24h,SRB法测定细胞存活水平。结果显示：与培养液对照比较,rhGraB-VRB对人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的增殖具有显著的抑制作用,rhGraB未见任何影响,而rhVRB则表现轻微的促生长作用。还发现低浓度rhGraB-VRB即对HUVEC细胞有很好的抑制作用,达到一定的剂量(8nmO1)时,对较低表达VEGF受体的肿瘤细胞CT-26的生长也有明显抑制作用,但对不表达VEGF受体的细胞的增殖无任何影响。3.4rhGraB-VRB对HUVEC的细胞毒作用用8nmol/LrhGraB-VRB处理人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,光镜下观察,发现rhGraB-VRB具有快速、强烈的细胞毒性作用。作用30min时,光镜下即可观察到细胞发生剧烈变化；处理12h时,大多数细胞死亡、裂解,仅剩细胞痕迹；而rhGraB处理12h的细胞则未见明显变化。3.5rhGraB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡以8nmol/LrhGraB-VRB处理人脐静脉血管内皮细胞HUVEC24h,采用TUNEL法分析细胞凋亡情况,发现只加培养液的对照组仅有少数细胞核TUNEL标记阳性,阳性率13%,而rhGraB-VRB处理的实验组细胞,绝大多数细胞核TUNEL标记阳性,阳性率89%。4结论我们将前期构建的重组表达载体pBADA-VRB、pBADA-GraB和pBADA-GraB-VRB转化长型双歧杆菌,经L-阿拉伯糖诱导表达了rhVRB、rhGraB和rhGraB-VRB蛋白；rhGraB-VRB能有效抑制KDR/Flk-1阳性细胞增殖,但对KDR/Flk-1阴性细胞则否；rhGraB-VRB可迅速引起KDR/Flk-1阳性细胞死亡,这种死亡的机制是细胞凋亡。结果表明,利用rhGraB-VRB蛋白抗肿瘤血管生成,模拟了淋巴细胞的生理性作用机制,克服了一般血管抑制剂只能抑制血管生成的缺点,既可破坏肿瘤新生的血管,又可直接攻击肿瘤细胞本身,能较好地抑制肿瘤的生长和转移。通过进一步的深入研究,这种工程化双歧杆菌可能通过口服方式在肠道内表达rhGraB-VRB,作用于新生血管内皮细胞,诱导其发生凋亡,达到靶向性治疗肠道肿瘤的目的,可望在防治大肠癌等肠道肿瘤方面取得较大突破。