论文部分内容阅读
目的:1.通过观察加减归肾丸(方)对早发性卵巢功能不全(脾肾不足、肝郁血瘀型)的血清性激素水平和证候积分疗效,探索补肾健脾、调肝活血法及药物在早发性卵巢功能不全治疗中的应用,为患者提供有效的中医药治疗选择,为今后探讨其抗卵巢衰老的作用机理奠定基础。2.对比分析早发性卵巢功能不全小鼠模型三种常用造模方法的差异,探索符合早发性卵巢功能不全临床特征的造模方法,力求找到更理想的早发性卵巢功能不全动物模型,为临床和实验研究提供参考。3.在动物层面,从影响异染色质聚集的角度探讨加减归肾丸(方)抗卵巢衰老的机理,初步明确加减归肾丸(方)干预后的小鼠卵巢组织衰老相关异染色质聚集形成主要相关蛋白的变化情况。方法:1.临床研究采用自身前后对照的临床试验方法,选取于北京中医药大学东直门医院就诊的26例POI患者给予加减归肾丸(方)中药口服治疗3个月经周期(闭经者治疗3个月),对患者治疗前后中医证候积分和改良的Kupperman量表积分、血清促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)水平进行评价,记录入组后患者体征舌脉及安全性指标,分析加减归肾丸(方)的临床疗效。2.动物造模研究将96只动情周期规律的ICR小鼠随机分为4组:空白对照组、雷公藤组、二氧化乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diep-oxide,VCD)组、半乳糖组。分别给予不同造模干预,分别于干预后第16、46和76天随机处死各组8只小鼠,检测小鼠血清血清FSH、LH、E2、抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)和抑制素B(inhibin B,INHB)水平、观察卵巢和子宫病理改变等。以分析和评价造模方法的优劣。3.体内药物实验将72只动情周期规律的ICR小鼠随机选取12只作为空白对照,其余采用VCD造成早发性卵巢功能不全小鼠模型。造模成功后将造模小鼠随机分为模型组、补佳乐组、加减归肾丸低剂量组、加减归肾丸中剂量组和加减归肾丸高剂量组,加减归肾丸各组分别与加减归肾丸高、中、低剂量溶液灌胃,补佳乐组予补佳乐溶液灌胃,模型组予等量生理盐水灌胃,每日1次,连续4周。给药期间观察小鼠一般状况及动情周期变化,给药结束后测定各组小鼠性激素水平,了解各组卵巢功能情况。在共聚焦显微镜下检测不同组别小鼠卵巢中颗粒细胞异染色质形态及聚集情况,观察加减归肾丸(方)对染色质结构的影响。测定卵巢组织SAHF标志性蛋白H3K9me3与HP1 α的变化,进一步了解加减归肾丸(方)对SAHF的影响。结果:1.临床研究:比较治疗前后患者情况,在中医证候积分方面,经治疗后患者均有不同程度的月经改善,包括恢复行经、月经量增多等。加减归肾丸(方)亦能改善腰膝酸软、性欲减退、潮热盗汗、烦躁易怒、胸闷胁痛、失眠多梦等症状,差异有统计学意义。治疗前后耳鸣、神疲乏力、小腹胀痛症状评分无统计学差异,治疗总有效率达到73%;在改良的Kupperman量表评分方面,治疗后患者潮热出汗、感觉异常、皮肤蚁行感症状评分显著下降,焦虑、肌肉关节痛、性生活疼痛评分亦有下降,差异有统计学意义。对于精神抑郁、头痛、尿频尿急症状无统计学差异;在实验室指标方面,患者血清FSH、LH值较治疗前明显减低,差异有统计学意义;E2值较治疗前有所升高,但无统计学差异。2.造模方法研究:雷公藤组小鼠在第16天时出现体重减轻,多数动物出现动情周期紊乱,AMH和E2值显著降低,发育中卵泡数和成熟卵泡数减少,子宫内膜变薄;第46天时小鼠体重恢复,E2值仍降低,发育中卵泡数和黄体数显著减少;但第46天时,除E2值仍持续偏低外,雷公藤组小鼠体重、血清性激素值及卵巢、子宫组织结构均与同期空白对照组无显著差异。半乳糖组小鼠在第16天时出现卵巢指数减低,AMH和E2值均减低,子宫内膜厚度减小;第46天时E2仍持续减低,发育中的卵泡数、黄体数减低;第76天时AMH和E2值减低,子宫内膜厚度减小,半数以上动物出现动情周期紊乱;VCD组小鼠在第16天时出现卵巢湿重及卵巢指数减低,AMH和E2值显著减低,FSH值和FSH/LH升高;第46天时小鼠体重、血清性激素与前无差异,发育中的卵泡数和黄体数较前进一步减少;第76天时小鼠AMH、LH、E2仍明显降低,FSH/LH比值升高,绝大多数小鼠出现动情周期紊乱,发育中卵泡数、成熟卵泡数均减少,子宫内膜和子宫肌壁厚度均减小。3.体内药物实验:动情周期:空白对照组小鼠全部有规律的动情周期,表现为6-7天出现一次规律动情周期,模型组造模后出现动情周期紊乱,主要表现为无规律的动情周期或动情间期延长。给药后,中药各剂量给药组部分小鼠动情周期逐渐开始恢复,给药结束时,中药高剂量组58%、中药中剂量组50%、中药低剂量组42%小鼠动情周期恢复规律;西药组33%小鼠动情周期规律,67%小鼠表现为持续动情期。血清性激素:与空白对照组相比,模型组AMH、INHB、E2值明显降低(P<0.05),FSH值、FSH/LH 比值显著升高(P<0.01)。中药高剂量组AMH、INHB值较模型组明显升高(P<0.01,P<0.05)。中药高、中剂量组、西药组E2值较模型组明显升高(P<0.01,P<0.05),中药中剂量组FSH/LH比值较模型组显著降低(P<0.05)。LH各组未产生显著差异(P>0.05),中药各给药组、西药组FSH值未与模型组产生差异(P>0.05)。异染色质聚集:模型组SAHF阳性细胞比例较空白对照组显著升高,说明卵巢衰老模型构建成功。与模型组相比,补佳乐组、中药高剂量组、中剂量组SAHF阳性细胞的比例明显降低(P<0.05),中药低剂量组SAHF阳性细胞比例虽较模型组有所降低,但未能产生统计学意义(P>0.05)H3K9me3和HP1蛋白在模型组卵巢中呈高表达,在空白对照组中低表达,在中药低剂量、中剂量、高剂量组中逐渐减少,西药组和中药高剂量组中表达相似,均较低。SAHF标志性蛋白含量:模型组HMGA1/HMGA2蛋白含有量显著高于空白对照组(P<0.01),给药4周后,各给药组HMGA1/HMGA2蛋白含有量较模型组均明显降低(P<0.01),含有量从低到高依次为:补佳乐组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组。结论:1.加减归肾丸(方)可以降低POI患者血清基础FSH、LH水平,改善月经情况、中医证候积分和围绝经期症状,表明加减归肾丸(方)对于改善POI患者卵巢功能有一定的治疗作用;2.化学毒性物质VCD能诱导小鼠卵巢功能减退,模拟POI的病理过程,在三种造模方法中最为优选,可作为探讨POI发病机理和用药研究的动物模型;3.加减归肾丸(方)可通过抑制衰老相关异染色质聚集,从而逆转卵巢发生过早衰老,进而相对促进卵泡的生长发育,使受损的卵巢功能得以恢复,或许为补肾健脾、调肝活血中药抗卵巢衰老的作用机制。