四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,常被用做花坛和地被布景。其中,应用较广的绿叶系列四季秋海棠‘超级奥林匹克’品种常因为环境改变而造成花色素苷合成的积累而变红。花色素苷是使植物体组织呈现红至紫色的主要物质,因而具有植物逆境胁迫的“指示剂”之称,因此,在研究环境诱导花色素苷合成方面四季秋海棠可以作为一种优良的研究材料。为了探究低温和高光环境下四季秋海棠叶片花色素苷合成的积累是否与NADPH氧化酶所介导产生的活性氧有直接关联,本研究对课题组前期所获得的NADPH氧化酶家族基因BsRnohD进行了克隆分析、组织特异性表达分析和亚细胞定位分析,通过农杆菌花序侵染的方法将其转化‘哥伦比亚’野生型拟南芥,以未转基因野生型拟南芥为对照分别进行低温和高光处理,并检测了拟南芥各株系的光合特性、生理指标以及相关结构基因的表达量。结果如下:1.从四季秋海棠中成功克隆出NADPH氧化酶家族基因BsRbohD基因(基因登录号为MH784503),该基因序列全长3796bp,CDS区长2784bp,共编码957个氨基酸。2.分别以四季秋海棠叶、雄花、雌花、茎和根的总RNA反转录后得到的各部位cDNA为模板,实时荧光定量PCR结果表明,BsRbohD基因在四季秋海棠叶片、雄花、雌花、茎和根中均有表达,但在不同组织中表达水平不同,其中根>雄花>雌花>叶>茎。3.成功构建了四季秋海棠BsRbohD基因GFP表达载体,以RFP质膜Marker蛋白表达载体为对照,通过注射入烟草叶片下表皮,使其在烟草叶片中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察发现四季秋海棠BsRbohD基因所控制的NADPH氧化酶蛋白定位在细胞质膜上。4.将四季秋海棠BsRbohD基因在拟南芥中异源表达,并通过潮霉素Hyb和基因组特异性PCR扩增的方法,鉴定筛选到T3代阳性植株。选取两个转基因阳性株系,以野生型拟南芥为对照,分别进行低温和高光处理。通过对转基因植株和野生型植株光合作用荧光参数测定,结合快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和“JIP-test”参数分析发现,野生型拟南芥植株与两个转基因株系在J点、I点和P点出现了明显差异,且均大于转基因株系,两个转基因株系之间无明显差异,两个转基因株系的Fv/Fm、Fv/Fo、ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo、REo/CSo、Sm、ETo/RC、REo/RC、PI abs和PI total值相比于野生型拟南芥均下降,而Fo/Fm、Vj、Vi、N、ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC和DIo/CSo值与野生型相比均上升,说明在拟南芥中异源表达四季秋海棠BsRbohD基因使拟南芥植物叶片的生理状态和光合机构都发生了变化。对其进行胁迫后测定各生理指标和相关基因相对表达量后分析发现,转基因株系面对环境突变比野生型要更加敏感,表现为超氧阴离子产生速率、过氧化氢含量、花色素苷含量、BsRbohD基因在时间上上调比野生型拟南芥要更快,在含量或表达量上比野生型也更高,而拟南芥相关几个花色素苷合成结构基因的表达量在胁迫后期比野生型也更高,其中对高光胁迫的敏感性要大于低温胁迫,说明该研究所克隆的四季秋海棠BsRbohD基因可以在拟南芥体内异源正常表达,其所控制的NADPH氧化酶功能正常,可以正常产生活性氧以应对环境改变,而由BsRbohD基因介导产生的活性氧可以作为信号分子直接或间接调控更多的花色素苷合成与积累。