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研究背景:原发性肝癌始终是威胁人类健康的一种疾病,在原发性肝癌中发生率最高的是肝细胞癌（HCC）。在世界流行病学统计中,HCC的发病率位列第5,致死率位列第3。在肿瘤细胞生长的过程当中,除了有关的细胞内部成分如基因、代谢方式等出现改变之外,还有一类非细胞成分也出现了变化,这就是细胞外基质（ECM）。ECM能够通过自身动态结构的优势协助肿瘤进展,并通过自身结构的重新合成和代谢调控肿瘤细胞的恶性表型。透明质酸（HA）则是构成ECM中的一部分,由于其高度亲水的物理化学特性,HA可调节组织稳态和对压缩力的抵抗力,通常存在于软骨组织、结缔组织,并可以作为组织修复信号。HA是由重复的二糖构成的长链糖胺聚糖,每个二糖均由D-葡糖醛酸（Glc UA）和N-乙酰葡糖胺（Gle NAc）缩合而成。HA的从头合成来自葡萄糖,它的两个前体物质分别来源于6-磷酸-葡萄糖（G-6-P）和6-磷酸-果糖（F-6-P）,因此HA的合成与糖酵解过程存在共同竞争底物的关系。大量研究表明HA含量在恶性肿瘤中过度积累,并且促进肿瘤的增殖、迁移、血管生成等恶性表型,与预后不良有关。草酰乙酸（OAA）是三羧酸循环中重要的中间产物,除了作为底物参与氧化磷酸化（OXPHOS）外,还具有许多其他生物学功能。目前已经发现在肝癌细胞Hep G2中低浓度OAA能够上调VEGF m RNA的表达从而促进血管生成,而高浓度OAA能够抑制糖酵解,增强OXPHOS,通过逆转Warburg效应诱导肝癌细胞Hep G2凋亡。由于不同浓度OAA对肝癌细胞Hep G2产生不同甚至相反的作用,而HA和OAA都与糖酵解有着密不可分的关系,并且有研究指出HA的产生并不取决于透明质酸合成酶（HAS）而是取决于HA合成底物。所以我们由此作为出发点,探究不同浓度OAA对肝癌细胞Hep G2产生不同作用的分子机理以及HA和OAA二者之间的关系。研究材料与方法:设计不同浓度梯度HA以及HA与HA抑制剂4-甲基伞形酮（4-MU）混合溶液培养细胞,通过细胞计数检测其实验的最适浓度;通过CCK-8细胞增殖实验验证HA对肝癌细胞Hep G2和肝正常细胞LO2细胞活力的影响;通过克隆形成实验验证HA对Hep G2细胞系增殖能力的影响;通过划痕实验验证HA对肝癌细胞Hep G2迁移能力的影响;通过Transwell实验验证HA对肝癌细胞Hep G2侵袭能力的影响;同样的方法检测不同浓度OAA对肝癌细胞Hep G2增殖、迁移、侵袭的影响;通过ELISA酶联免疫吸附试验检测不同浓度OAA对HA合成的影响;通过q RT‐PCR实验检测HAS1、HAS2、HAS3m RNA在肝癌细胞Hep G2和肝正常细胞LO2中的表达,以及在不同OAA浓度下的表达,验证不同浓度OAA对HA合成的影响独立于HAS转录;通过试剂盒检测不同浓度OAA对糖酵解关键酶己糖激酶活性以及糖酵解产物乳酸产量的影响;最后通过Western blot实验检测不同浓度OAA下AKT/p-AKT的蛋白表达。研究结果:通过我们的研究发现,40-100KDa的HA能够促进肝癌细胞Hep G2的增殖;且确定了实验外源性添加HA的最佳浓度为100μg/ml,4-MU的最佳浓度为0.3m M;CCK-8实验证明HA能够提高Hep G2和LO2的细胞活力,但是对Hep G2的影响更大;克隆形成实验证明HA促进肝癌细胞Hep G2的增殖;划痕实验证明HA促进肝癌细胞Hep G2的迁移;Transwell实验证明HA促进肝癌细胞Hep G2的侵袭;ELISA酶联免疫吸附实验证明20m M OAA促进肝癌细胞Hep G2中HA的合成,50m M OAA抑制肝癌细胞Hep G2中HA的合成;CCK-8实验、克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验证明20m M OAA促进肝癌细胞Hep G2的增殖、迁移和侵袭,50m M OAA抑制肝癌细胞Hep G2的增殖、迁移、侵袭;q RT-PCR表明HAS1、HAS3的m RNA在肝癌细胞Hep G2中低表达,两种浓度OAA对LO2细胞系中的HAS的表达没有影响,20m M OAA对Hep G2细胞系中三种HAS没有影响,50m M OAA提高了HAS1和HAS3在Hep G2细胞系中m RNA的表达水平,说明了不同浓度OAA对HA合成的影响独立于HAS转录;HK检测证明20m M OAA增加HK活性,50m M OAA抑制HK活性;乳酸检测证明两种浓度OAA都抑制乳酸的产生;Western blot实验证明20m M OAA激活AKT的磷酸化,50m M OAA抑制AKT的磷酸化。研究结论:1.不同浓度OAA对肝癌细胞恶性表型存在差异性影响,低浓度OAA促进肝癌细胞恶性表型,高浓度OAA抑制肝癌细胞恶性表型。2.低浓度OAA通过增加HA合成进而促进肝癌细胞恶性表型,高浓度OAA通过抑制HA合成及糖酵解进而抑制肝癌细胞恶性表型,且OAA对HA的影响与HAS无关。3.本研究提示较高浓度的OAA对于肝癌的治疗具有潜在的药理学意义。