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从正常人全脑marathoncDNA中克隆到人生物节律基因BMALl和CRYl的开放读码框架(ORF),经酶切和测序鉴定与GeneBank数据库中收录的序列基本一致。其中BMALl定位于染色体1lpl5,含有20个外显子和19个内含子;编码蛋白626aa,分子量为68kDa;蛋白序列与已知的ARNT和AHR高度同源,为含有bHLH-PAS结构的转录调控因子;在果蝇、爪蟾、小鼠、大鼠和人等生物中均有同源物表达。CRYl定位于12q23—24.1,含13个外显子和12个内含子;编码蛋白586aa,分子量66kDa;蛋白序列与果蝇photolyase同源,两种CRY蛋白结构上同源性高,都含有DNAphotolyase和FADDNAbinding结构域;从果蝇到小鼠和人都可以发现CRYl的同源物表达。
通过Northern杂交MTN多组织膜片显示,BMALl有3个转录本,分别为2.0kb、2.8kb和5.0kb,其在心、胎盘、肝、骨胳肌和肾中都有较高水平的表达;CRYl有1个约3.0kb的转录本,在各种正常人组织中都有表达。RT-PCR也可以从正常肝组织、胎盘、卵和脑中扩增出BMALl与CRYl基因片段。说明BMALl与CRYl可以在各种人正常组织中表达。通过RT-PCR在4种肝癌细胞,2种脑胶质瘤细胞,2种肺癌细胞,乳腺癌细胞,卵巢癌细胞,宫颈癌细胞,骨肉庙细胞等13种肿瘤细胞中检测到BMALl和CRYl的表达。说明这两种生物节律基因不仅在各种人正常组织中表达,同样在离体培养的肿瘤细胞中也可以表达。
为了检测BMALl与CRYl在肝癌与癌旁组织中的表达差异,分别使用了Northernblot、半定量RT-PCR和免疫组织化学方法分析。Northernblot结果显示,在8对肝癌与癌旁组织中,BMALl和CRYl均在87.5%(7/8)癌旁组织中有相对高的表达;反转录PCR检测另外8对肝癌与癌旁组织结果为,BMALl和CRYl在62.5%(5/8)的癌旁组织中有相对高的表达;免疫组化分析163对肝癌与癌旁组织中BMALl的表达在癌旁组织(53%)高于肝癌(23%),而CRYl在185对样品中也于癌旁组织(29%)高于肝癌中(12%)。以上试验说明,BMALl和CRY1-基因在肝癌及对应的癌旁组织中都有表达,而且在同样的样品中呈现癌旁表达高于肝癌组织的趋势。
GFP亚细胞定位确定二者均定位于细胞核中,与以前在其它生物中细胞定位的结果一致,说明二者的生物作用主要发生在核内。将BMALl与CRYl均亚克隆到真核表达载体稳定转染SMMC-7721细胞,通过测定生长曲线和在软琼脂克隆数以及在裸小鼠体内形成的瘤重,检测体外与体内细胞增殖试验,均未见有生长速度上的明显差别。而初步检测5种生物节律相关基因(CLOCK,BMALl,WEEl,PER2和CRYl)在稳定过表达BMALl或CRYl的细胞中的表达水平虽有变化,但未显示有可见的规律。说明体外过表达一种生物节律基因对细胞增殖的影响并不明显。