背景:心肌梗死患者的异常心肌纤维化会导致心功能异常及预后不良。越来越多的研究发现泛素蛋白酶体系统在纤维化的病理过程中起着重要作用。泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)是泛素蛋白酶体系统的一个成员,与多种心脏疾病导致的纤维化息息相关。然而,UCHL1能否调节心肌梗死后心肌纤维化仍然未见报道。方法:为了检测UCHL1在心肌梗死后心肌纤维化中的表达,我们通过结扎左冠状动脉前降支建立了C57小鼠心肌梗死模型,免疫组化检测术后1d、7d和14d心脏UCHL1的表达,western blot检测术后1d、7d和14d心脏UCHL1和促纤维化因子Col1和α-SMA的蛋白表达水平。为验证UCHL1是否在心肌梗死后心肌纤维化中发挥作用,心肌梗死小鼠术后1d开始腹腔注射UCHL1的抑制剂LDN57444(LDN)持续14d,处理结束后用western blot和马松三色染色检测其心肌纤维化和心肌梗死面积,用超声心动图检测其心功能。其后,我们用正常C57小鼠的心脏提取原代心脏成纤维细胞,并用TGF-β1诱导心脏成纤维细胞的活化,western blot检测TGF-β1刺激12h、24h和36h后的UCHL1和促纤维化因子Col1和α-SMA的蛋白水平。用LDN作用于活化的心脏成纤维细胞,并用western blot检测Col1和α-SMA的蛋白水平。用UCHL1 siRNA处理活化的心脏成纤维细胞,western blot检测Col1和α-SMA的蛋白水平,免疫荧光法检测α-SMA的表达。为探索UCHL1的作用机制,筛选UCHL1的相互作用的蛋白,用TGF-β1诱导活化的心脏成纤维细胞的蛋白样品进行UCHL1免疫沉淀,并用洗脱的蛋白进行质谱分析。免疫共沉淀验证TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞中UCHL1和筛选出来的葡萄糖调节蛋白78 k Da(glucose-regulated protein of 78 k Da,GRP78)之间的相互作用。随后,用免疫荧光检测假手术心脏/心肌梗死心脏和非TGF-β1诱导/TGF-β1诱导心脏成纤维细胞中UCHL1和GRP78之间的共定位。为探索UCHL1对GRP78的调控形式,我们检测了scrambled siRNA/UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞的GRP78的蛋白水平变化。用环磷酰胺追踪实验检测环磷酰胺作用于scrambled siRNA/UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞0h、1h、2h、3h、4h和5h后的GRP78的蛋白水平。予以MG132处理以抑制蛋白降解,其后用GRP78抗体进行免疫沉淀,检测scrambled siRNA/UCHL1siRNA转染的心脏成纤维细胞中GRP78的泛素化水平。为探索UCHL1是否经由GRP78调控心肌纤维化,我们检测了在TGF-β1作用下的scrambled siRNA/UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞的GRP78的蛋白水平变化。用GRP78抑制剂HA15处理scrambled siRNA/UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞,检测Col1和α-SMA的蛋白表达。结果:在本研究中,我们发现在C57小鼠在心肌梗死后7d和14d心脏中的UCHL1和促纤维化因子Col1和α-SMA蛋白水平显著增加。动物实验发现,LDN显著降低心肌梗死后心脏中Col1和α-SMA的蛋白表达水平,显著减少心肌梗死后梗死面积和心肌纤维化,改善心功能。TGF-β1刺激的心脏成纤维细胞24h和36h后UCHL1和促纤维化因子Col1和α-SMA的蛋白水平显著增加。LDN同样可以明显抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞中Col1和α-SMA的蛋白表达。同时我们发现UCHL1 siRNA处理TGF-β1诱导心脏成纤维细胞,同样可以抑制其促纤维化因子Col1和α-SMA的蛋白表达水平。随后,我们通过免疫沉淀-质谱法筛选出PSMs>20的6个UCHL1的相互作用蛋白的候选分子:Endoplasmic reticulum chaperone Bi P(也被称为GRP78)、Annexin A6、Carnitine O-palmitoyltransferase 1,muscle isoform、Glycogen phosphorylase,brain form、Elongation factor Tu,mitochondrial和Cysteine and glycine-rich protein 3。我们进一步通过免疫共沉淀证明了在TGF-β1诱导的活化的成纤维细胞中存在UCHL1和GRP78的相互作用。免疫荧光证明了在心肌梗死小鼠心脏的梗死区UCHL1和GRP78存在共定位,在心脏成纤维细胞中无论是否经过TGF-β1诱导活化均可发现UCHL1和GRP78存在明显的共定位。我们发现在UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞中GRP78的蛋白水平明显增加。环磷酰胺追踪实验发现在UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞中GRP78的降解速度明显减慢。GRP78的泛素化实验发现UCHL1 siRNA转染的心脏成纤维细胞中GRP78的泛素化水平显著降低。我们发现在TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞中GRP78蛋白水平显著增加,UCHL1 siRNA的处理可导致其进一步增加。GRP78抑制剂HA15可减弱UCHL1 siRNA引起的活化的心脏成纤维细胞的促纤维化因子Col1和α-SMA的蛋白表达的增加。结论:在心肌梗死小鼠心脏中的UCHL1蛋白水平明显增加。LDN能显著减轻心肌梗死后心肌纤维化,改善心功能。在TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞中的UCHL1蛋白水平明显增加。LDN和UCHL1 siRNA均可减少TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞的活化。UCHL1与GRP78之间存在相互作用,前者可泛素化后者,从而降低后者的蛋白水平。GRP78可能是UCHL1促纤维化的作用位点。总之,我们发现UCHL1-GRP78轴参与心肌梗死后心肌纤维化,为减少心肌梗死后心肌纤维化提供了重要的研究方向。