【摘 要】
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[研究目的]利用脂肪组织与胶原蛋白联合,构建胶原蛋白-脂肪联合体系,以探究胶原蛋白是否可以促进脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem Cells,ADSCs）及内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）归巢至脂肪组织内,进一步发挥ADSC及EPC的生物效应,提高脂肪移植的存活率。[方法]（1）颈椎脱臼处死SD大鼠,取双侧股骨骨髓进行分离、培养
【基金项目】
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国家自然科学基金（81860343）； 云南省医学学科带头人（D2019026）； 云南省基础研究面上项目（3027GN121）；
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[研究目的]利用脂肪组织与胶原蛋白联合,构建胶原蛋白-脂肪联合体系,以探究胶原蛋白是否可以促进脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem Cells,ADSCs）及内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）归巢至脂肪组织内,进一步发挥ADSC及EPC的生物效应,提高脂肪移植的存活率。[方法]（1）颈椎脱臼处死SD大鼠,取双侧股骨骨髓进行分离、培养和鉴定内皮祖细胞（EPC）;取双侧腹股沟脂肪组织进行分离、培养和鉴定脂肪来源干细胞（ADSC）。（2）ADSCs和EPCs归巢检测:取腹股沟区脂肪组织,制备颗粒大小脂肪,吸取400ul颗粒脂肪与300ul Ⅰ型胶原蛋白（0.1mg/ml）充分混合,将混合物移植在实验SD大鼠背部,构建胶原蛋白-脂肪联合体系。移植后2天及14天,从尾部注射被荧光素酶及染料标记ADSC及EPC,通过活体成像、凝胶电泳、RT-qPCR定量、共聚焦显微镜等技术,观察ADSC及EPC在移植脂肪内归巢情况。（3）归巢下生物效应观察:同归巢实验制备胶原蛋白-脂肪联合体系。实验分组为PBS组（PBS+颗粒脂肪）、胶原组（胶原蛋白+颗粒脂肪）、ADSC组（胶原蛋白+颗粒脂肪+ADSC）、EPC组（胶原蛋白+颗粒脂肪+EPC）,通过移植脂肪外形、体积、重量、HE染色、Masson染色、免疫组化CD31等观察移植脂肪的性状变化。[结果]（1）活体成像检测:移植后2天及14天注射ADSCs和EPCs,信号都集中于大鼠腹部及尾部。（2）电泳检测:实验组都成功从移植脂肪中扩增出1uc基因。移植后2天注射ADSC:胶原组和PBS组电泳灰度很浅,且无差异;移植后14天注射ADSC及EPC:胶原组电泳灰度明显深于PBS组。（3）RT-qPCR定量:实验组成功从移植脂肪中定量出luc基因。移植后2天注射ADSC:胶原组、PBS组luc基因定量均很低,且无差异;移植后14天注射ADSC及EPC:胶原组Luc基因定量明显高于PBS组。（4）共聚焦显微镜检测:被染料标记的干细胞信号胶原组明显多于PBS组。（5）归巢下生物效应观察:①HE及Masson染色显示,PBS组炎症重,其中有许多空泡,脂肪细胞数量少,其余各组空泡及炎症明显较少,且ADSC组有许多新生脂肪细胞。②CD31免疫组化显示微血管数量:ADSC组>EPC组>胶原组>PBS组。③ADSC和EPC组移植脂肪的体积及重量高于胶原组和PBS组。[结论]1.对于ADSCs-luc基因荧光素酶标记ADSC,载体pLVX-EF1 α-mcherry转染效率优于 pLVX-IRES-ZsGreen1;2.Rt-qPCR及共聚焦显微镜用于检测ADSCs和EPCs归巢,检测灵敏度优于生物发光活体成像;3.Ⅰ型胶原蛋白联合ADSCs可明显促进新生脂肪细胞形成;4.Ⅰ型胶原蛋白联合ADSCs和EPCs可以刺激移植脂肪组织血管重建,减轻炎症,降低空泡形成,减缓移植脂肪吸收速度;5.Ⅰ型胶原蛋白-脂肪联合体系可以促进ADSC及EPC归巢至移植的脂肪组织。
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