细胞色素P450(CytochromeP450/CYP)包含了一个色素蛋白的超家族，在各种生物的异生物质包括药物、杀虫剂，各种污染物，自然界中的毒素以及各种生物内源物质如维生素，甾类激素等的代谢中起中心作用。有机合成杀虫剂的广泛应用，使目前已有至少500种以上的昆虫和螨类对一种或者多种杀虫剂发展了抗性。氰戊菊酯((RS)-α-氨基-3-苯氧基苄基(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯，Fenvalerate)，是一种Ⅱ型拟除虫菊酯类化学杀虫剂，具有高效、低毒、低残留的突出优点，然而多年的实际应用已使一些昆虫对其产生了抗性。大量相关研究亦表明P450s是对菊酯类杀虫剂发挥主要作用的酶类，但对P450作用的分子机制却了解的较少。本研究通过氰戊菊酯处理昆虫Trichoplusiani(Tn)细胞，采用化学检测、蛋白质组学、及实时定量反转录PCR等多种方法观察处理过程中P450表达的变化及涉及的相关蛋白，对P450s的诱导作用机制及其与昆虫抗药性的关系做了有意义的探讨，本研究的结果对认识P450s参与的杀虫剂抗性的发生发展机制和指导病媒防治具有重要意义。本研究获得了以下试验结果： 1、以不同浓度梯度氰戊菊酯处理昆虫细胞Tn，并用台盼兰染色，MTT(3-(4，5-Dimethylthiazol)-2，5-diphenyltrazoliumbromide)还原试验及流式细胞仪检测等方法对细胞的活力进行了测定。结果显示，氰戊菊酯处理的浓度大于17.5μmol/L时，细胞的死亡率升高到29.69％以上，极显著高于对照(P＜0.01)，细胞对MTT试剂的还原物吸光值降低，细胞的相对活力极显著下降(P＜0.01)；用流式细胞仪检测的结果也证实，氰戊菊酯的浓度为25μmol/L时，死亡与凋亡的细胞数明显高于对照。因此确定了不影响细胞活力的浓度范围为0-15μM。 2、在前面细胞活力试验的基础上，设置不影响细胞活力的氰戊菊酯浓度梯度处理Tn细胞12h，并以最适处理浓度-12.5μM氰戊菊酯分别处理Tn细胞0、3、6、9、12、24、48h，提取微粒体，测定细胞中总P450s的含量。结果：P450s的含量随氰戊菊酯浓度的增加而升高，并在氰戊菊酯浓度为12.5μM时达到最高(8.562nmol/mgprotein)，随后下降；P450s的含量也随处理时间的延长而升高，并在12h达到最高(5.28±1.14nmol/mgprotein)，随后下降。因此，氰戊菊酯可诱导Tn细胞色素总P450s的变化，先随浓度和处理时间增加到顶点后，过高的浓度和过长的处理时间反而抑制P450的含量。在处理浓度为12.5μM，处理时间12h时细胞总P450含量最高。 3、为了揭示昆虫中细胞色素P450对氰戊菊酯代谢的机制，我们用双向电泳展示了氰戊菊酯处理前后昆虫细胞系(Tn)细胞总蛋白中各种蛋白表达量的变化，并对表达变化的蛋白用质谱测定的方法予以鉴定。结果显示，用双向电泳分离出Tn细胞的1300多个蛋白中，有33个表达发生了变化，其中8个下调，25个上调。通过质谱鉴定，其中有3个细胞色素P450的同工酶表达上调，其它蛋白可能与P450表达的信号转导途径有关。 4、按鉴定出的3个P450基因序列设计引物用于扩增该基因的cDNA片段并用半定量方式对比氰戊菊酯处理前后表达量对比，结果表明，扩增出的一个P450CYP4L4在处理后的的cDNA表达量显著高于对照(P＜0.05)。此片段被克隆并在GeneBank中登录。用实时定量方式对用氰戊菊酯各种梯度浓度、及在固定浓度不同时间梯度处理下Tn细胞的CYP4L4在mRAN水平表达变化进行测定，结果显示，这一变化与总的P450表达的模式相似。因此，氰戊菊酯可能通过已知的信号途径诱导P450的表达，其中P450CYP4L4可能通过羟化的方式解毒氰戊菊酯。 5、通过二维液相色谱分离技术分析氰戊菊酯处理前后Tn细胞系蛋白质谱的变化。结果显示，对照组与处理组于一维各收集了44个组分，再经二维各收集了1980个组分，其中有134个差异组分，42个组分上调，82个组分下调，从中鉴定出真核细胞转录因子及类似于负责果蝇嗅觉信号传递的穿膜受体。结合前面鉴定出的P450CYP4L4为嗅觉物质代谢相关酶，氰戊菊酯诱导前后Tn细胞中蛋白表达的变化可能与P450s诱导途径中某些受体的变化有关。 我们的研究结果表明：氰戊菊酯可诱导Tn细胞中P450表达的变化；氰戊菊酯可能通过传统的表达通路诱导Tn细胞中P450的表达，并可能通过羟基化的方式使氰戊菊酯的水溶性增加。