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继手术,放疗,化疗后,肿瘤的免疫疗法已成为第四种行之有效的治疗手段,近期因发展迅速,而广受关注。其中,嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptors-T cell,CAR-T)是一种新兴的过继细胞疗法(Adoptive cell transfer therapy,ACT),该技术将患者的T细胞在体外修饰,活化和增殖后回输到患者体内,通过T细胞表达的特异性受体,靶向性的识别肿瘤细胞,并显示较强的杀伤活性和持久性。PD-L1(Programmed death ligand-1)是程序性死亡分子1(Programmed death-1,PD-1)的配体,主要诱导性的表达在上皮细胞(如肿瘤细胞)和免疫细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞)等,在免疫应答负调控中发挥重要作用,PD-1/PD-L1信号通路的激活,有利于形成肿瘤微环境,使肿瘤细胞逃避免疫系统的免疫监视和免疫杀伤,而阻断该信号通路,在一定程度上,促进可识别肿瘤抗原并产生特异性反应的T细胞增殖,发挥其杀伤肿瘤细胞的作用。故本课题设计了PD-L1抗原特异CAR-T细胞,既可以阻断PD-1/PD-L1信号通路,提高T细胞介导的肿瘤免疫治疗,又可以特异性的杀死肿瘤细胞,并且构建的第三代CAR基因,可以增强杀伤的活性和持久性。本研究构建了PD-L1(73-739)基因的原核表达载体,分离纯化His-PD-L1融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术和有限稀释法,筛选获得2株能够稳定分泌PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞腹腔接种BALB/c雌性小鼠,通过收集腹水制备并纯化抗体,进行Western Boltting验证,利用ELISA法检测,优选其中一株杂交瘤细胞株,提取杂交瘤细胞总RNA,逆转录合成第一链cDNA,PCR扩增单克隆抗体单链可变区片段,克隆片段经人源化替换与共刺激信号分子CD28、CD137和胞内信号分子CD3-ζ链的基因组合,构建并合成第三代CAR基因,将合成的CAR基因构建于慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP上,慢病毒载体与包膜载体pLP1、pLP2以及包被载体pLP-VSVG按照优化比例,利用脂质体3000共转染到293T细胞完成慢病毒包装,使用PEG浓缩法,获得有活性的抗PD-L1慢病毒,使用CD8+磁珠分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的CD8+T细胞,经过体外刺激,慢病毒感染CD8+T细胞,待其扩增5 d左右,进行CAR表达的测定,扩增20倍左右,利用非放射性细胞毒性杀伤CytoTox 96和ELISA法检测IFN-γ的分泌来测定CAR-T细胞的体外活性。本研究在成功制备了PD-L1单克隆抗体的基础上,进一步构建了PD-L1特异性的嵌合抗原受体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-CAR,转染293T细胞的效率可达到95.66%以上。包装的慢病毒的滴度可达到测定滴度的结果为5×10~7 TU/mL,可成功感染CD8+T细胞,CAR的表达率可达到22%以上。经过CAR-T细胞的体外活性测定,证明PD-L1特异性CAR-T细胞有一定的杀伤力,为进一步的体内试验研究和临床试验提供了重要的技术支撑。