【摘 要】
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α-葡聚糖酶能够特异性的识别并切断α-葡聚糖中的α-1,6糖苷键从而将其降解,在制糖工业及预防龋齿等方面展现出重要的应用潜力。目前已有多篇文献报道从细菌、霉菌及酵母中
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α-葡聚糖酶能够特异性的识别并切断α-葡聚糖中的α-1,6糖苷键从而将其降解,在制糖工业及预防龋齿等方面展现出重要的应用潜力。目前已有多篇文献报道从细菌、霉菌及酵母中分离得到了多种α-葡聚糖酶。来源于细丽毛壳的α-葡聚糖酶,被证明具有优良的酶学性质,能够耐受较高的温度,且在较为广泛的pH范围内可以稳定存在并保持良好的酶活,因而在制糖工业中应用前景甚佳。然而,迄今为止,细丽毛壳α-葡聚糖酶的编码基因序列一直未见有报道。本课题选取细丽毛壳CGMCC3.3783为研究对象,首先对其所分泌的原始蛋白进行了分离纯化,得到了两个分子量分别为70kDa和67kDa的纯α-葡聚糖酶CGD-1和CGD-2。研究发现,CGD-2较CGD-1表现出更好的酶学性质。我们提取了细丽毛壳基因组DNA和RNA,通过基因走读和RACE得到了一条α-葡聚糖酶的编码基因序列(cgdex),其开放阅读框长为1788bp,不存在内含子,推测其编码蛋白包含595个氨基酸,预测的蛋白分子量为65.96kDa。将cgdex基因分别在大肠杆菌、毕赤酵母及解脂耶氏酵母中进行异源表达,重组蛋白在毕赤酵母GS115中呈现出最佳的表达效果。最高酶活达到29.36U/m1,蛋白浓度为0.61mg/ml。重组α-葡聚糖酶的最适温度和pH分别为56℃和5.0,与细丽毛壳原始蛋白CGD-2相吻合。通过点突变,发现细丽毛壳α-葡聚糖酶氨基酸序列保守区域内第401位的Asp对酶活会产生较大影响,推测该位点位于细丽毛壳α-葡聚糖酶的酶活中心。相信本研究,会对α-葡聚糖酶的大规模商业化生产应用产生积极的意义。
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