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绿色植物是生物圈最主要的生产者,通过光合作用将太阳能转化为生物能,从而为地球的其他生命提供能量。在植物的演化过程中最主要的演化方向是由水生过渡到陆生。植物登陆影响了地球生命的演化,奠定了生物多样性的基础。原始植物登陆过程中面临的主要问题之一是如何吸收、运输水分以及控制蒸腾作用。为此,植物演化出了一系列的结构和信号转导系统。其中脱落酸（Abscisic acid,ABA）信号通过控制植物根系发育和调节气孔开闭直接影响水分的吸收和蒸腾,从而成为高等植物响应干旱胁迫、盐胁迫等非生物胁迫的主要信号途径。目前被子植物的ABA信号转导途径已基本被解析清楚,其核心元件包括:ABA受体（Pyrabactin Resistance/PYR1-Like/Regulatory Component of ABA Receptor,PYR/PYL/RCAR）,蛋白磷酸酶2C家族（protein phosphatases 2 C,PP2C）,蔗糖非酵解型蛋白激酶2家族（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinases 2,Sn RK2）。作为早期登陆植物,苔藓植物没有真正的根,也没有典型的由保卫细胞组成的气孔器。然而,近期的研究表明藓纲植物小立碗藓（Physcomitrella patens）和被子植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）之间存在一个保守的ABA信号传导途径,其Sn RK2家族成员Pp OST1被证明可以调节拟南芥保卫细胞的开闭。在苔纲植物地钱（Marchantia polymorpha）中,研究人员发现其被子植物ABA信号转导核心元件的同源基因,包括受体,磷酸酶和激酶均能不同程度的参与ABA信号转导。虽然在之前的研究中已经鉴定出地钱的ABA受体和磷酸酶PP2C都参与了ABA信号转导,但是关于地钱Sn RK2的演化和功能还知之甚少。为研究地钱Sn KR2家族成员的功能及演化,本研究基于地钱基因组数据,通过生物信息学分析发现,地钱中Sn RK2家族只有两个成员,将其分别命名为MpSnRK2.1和MpSnRK2.2,进行了一系列的生物信息学、分子生物学、生物化学和转基因研究,取得了以下研究结果:1.MpSnRK2.1和MpSnRK2.2基因克隆与生物信息学分析通过motif分析和基因结构分析发现地钱的两条Sn RK2虽然在motif上与被子植物高度相似,但是在基因结构上差异很大,MpSnRK2.2与拟南芥At Sn RK2.2/3一样,都有9个外显子,而MpSnRK2.1仅有1个外显子。2.MpSnRK2.1和MpSnRK2.2的转录受到ABA诱导使用荧光定量PCR分析不同浓度ABA处理的地钱配子体中MpSnRK2.1和MpSnRK2.2的相对表达量发现MpSnRK2.1在ABA浓度为0.25μM和0.5μM的处理条件下其相对表达量没有显著变化,只有在ABA浓度上升到1μM时才会受到诱导;而MpSnRK2.2在ABA浓度为0.25μM时其表达量就有显著提高,在ABA浓度为0.5μM时提高幅度最大。以上结果表明MpSnRK2.1和MpSnRK2.2的转录都受到ABA诱导,但是两者对ABA的敏感性有差异,MpSnRK2.2对ABA更加敏感。3.MpSnRK2.1定位于细胞核而MpSnRK2.2定位于细胞核和细胞质亚细胞定位证实了MpSnRK2.1定位在细胞核中,与地钱ABI1的定位一致;而MpSnRK2.2不仅定位在细胞核中,在细胞质上也存在强烈的荧光信号。与拟南芥中At Sn RK2.6相同,均在细胞核和细胞质中表达。亚细胞定位分析表明MpSnRK2.1和MpSnRK2.2在细胞内的分布具有明显差异。4.MpSnRK2.1和MpSnRK2.2均具有自磷酸化能力为验证MpSnRK2.1和MpSnRK2.2激酶的自磷酸化能力,本研究利用大肠杆菌表达系统获得了MpSnRK2.1和MpSnRK2.2的重组蛋白。使用基于Phos-tag的蛋白质磷酸化验证方法发现MpSnRK2.1和MpSnRK2.2在添加了Phos-tag的SDS-PAGE胶上迁移变慢,而使用碱性磷酸酶处理去磷酸化蛋白质上的部分磷酸基团之后,MpSnRK2.1和MpSnRK2.2的迁移变快。在不添加Phos-tag的SDS-PAGE胶上MpSnRK2.1和MpSnRK2.2的迁移率不会由于添加ATP或碱性磷酸酶发生改变。以上结果表明MpSnRK2.1和MpSnRK2.2都具有自磷酸化能力。5.MpSnRK2.1与Mp ABI1有相互作用而与At ABI1/At ABI2没有相互作用PP2C是ABA信号转导通路中上游的核心元件。在ABA信号转导中,PP2Cs能与Sn RK2相结合并调控其活性。拟南芥中At ABI1和At ABI2是主要的参与ABA信号转导的PP2C,而地钱基因组中仅有一个ABI1的同源基因Mp ABI1,已报道其同样可以参与ABA信号转导。为了验证MpSnRK2.1的功能,本研究使用酵母双杂交技术分析了其与Mp ABI1和At ABI1,At ABI2的相互作用。酵母双杂交（Y2H）结果显示同时转化MpSnRK2.1和Mp ABI1的酵母在氨基酸缺陷筛选培养基上能够正常生长,而对照组在氨基酸缺陷筛选培养基上不能生长。同时表达MpSnRK2.1和At ABI1或同时表达MpSnRK2.1和At ABI2的酵母不能在氨基酸缺陷筛选培养基上正常生长。以上实验表明MpSnRK2.1与Mp ABI1有相互作用而与At ABI1/At ABI2没有相互作用。6.MpSnRK2.2与Mp ABI1,At ABI1和At ABI都有相互作用酵母双杂交（Y2H）结果显示同时表达MpSnRK2.2和Mp ABI1的酵母,同时表达MpSnRK2.2和At ABI1,同时表达MpSnRK2.2和At ABI2的酵母都能在氨基酸缺陷筛选培养基上正常生长,而对照组在氨基酸缺陷筛选培养基上不能生长。表明MpSnRK2.2与Mp ABI1,At ABI1和At ABI2都有相互作用。7.在拟南芥中过表达MpSnRK2.2导致转基因拟南芥对ABA更敏感由于MpSnRK2.2与拟南芥的At ABI1和At ABI2都有相互作用,因此本研究将其在拟南芥中超量表达后发现过量表达MpSnRK2.2拟南芥对ABA更加敏感。在不添加ABA的MS培养基上,过表达MpSnRK2.2拟南芥与野生型的生长没有显著差异;而在添加了ABA的MS培养基上过表达MpSnRK2.2拟南芥的根长显著短于野生型对照,仅为对照的37.7%到54.3%。综上所述,本研究分析并克隆地钱SnRK2家族的两个成员MpSnRK2.1和MpSnRK2.2,进化树分析表明两者都位于Sn RK2的第三亚家族。MpSnRK2.1和MpSnRK2.2都具有自磷酸化能力,但是在基因结构、序列相似度、对ABA的响应程度、亚细胞定位和与ABI1的互作模式上两者都有差异。相较于MpSnRK2.1,MpSnRK2.2不但基因结构和氨基酸序列与拟南芥的Sn RK2第三亚家族成员更为相似,还能与拟南芥的At ABI1和At ABI2相互作用。在拟南芥中过量表达MpSnRK2.2导致转基因拟南芥对ABA更加敏感。以上结果表明地钱Sn RK2基因家族已经发生了功能分化,MpSnRK2.2在基因结构与功能上与被子植物Sn RK2更为相似,相较于MpSnRK2.1更为进化。本研究初步探索了地钱Sn RK2家族成员的演化和功能分化,为研究陆生植物ABA信号转导的演化提供了新的视角。