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双乙酰(diacetyl)是啤酒发酵中的不良风味物质,产生令人不愉快的反应,可以缩短啤酒熟化周期,提高生产效率,对啤酒工业来说极有经济价值。α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,EC.4.1.1.5.简称为ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸(α-acetolactate)脱羧形成乙偶姻(acetoin),避免双乙酰的生成。由于酵母菌不能产生ALDC,控制双乙酰含量的主要方法之一就是在啤酒发酵中添加ALDC制剂。本研究开展了以下几方面的工作。首先,由乙酰乙酸乙酯甲基化制备α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯,再经水解生成α-乙酰乳酸,作为测定α-乙酰乳酸脱羧酶活力的底物。其次,从土壤和水体中分筛选出7株具有较高酶活性的菌株,酶活最高的分类鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。再其次,利用PCR技术从枯草芽孢杆菌总DNA中克隆到0.77 kb的DNA片段。测序结果表明该片段与报道的序列相比[65],核苷酸序列同源性为98%、氨基酸序列同源性99.6%。将该片段插入到原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5ɑ(Escherichia coli 5ɑ),经热诱导后,SDS-PAGE分析表明ALDC基因实现了活性表达。最后,根据已知基因序列[31],利用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆到0.8kb的DNA片段。将该片段插入到原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5ɑ,经热诱导后,通过SDS-PAGE分析和酶活测定,表明ALDC基因获得了高效表达,重组细胞ALDC活力是出发菌株的1100倍。DH5ɑ(pBVEDAD)在无选择压力下37℃连续培养60代,在42℃下热诱导5小时未见质粒丢失。本研究为开发利用α-乙酰乳酸脱羧酶奠定了坚实的基础。