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自2016年在患有类似皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis nephropathy syndrome,PDNS）的母猪组织中检出猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）以来,PCV3检出率呈不断上升趋势,给全球养猪业造成了严重威胁。目前PCV3研究主要集中在流行病学和诊断方法等方面,而免疫机制及疫苗研发相关的研究报道较少。PCV3 ORF2基因编码的衣壳蛋白（Capsid protein,Cap）,其能诱导动物机体产生特异性的免疫应答反应,可被应用于PCV3致病机制的研究和基因工程疫苗的构建。虽然PCV2已有商品化的疫苗,但两种病毒的抗原交叉保护性较低,PCV2免疫不能保护猪群免于PCV3的感染。伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）可感染各个日龄的猪,引起不同的临床症状和病理变化。2011年伪狂犬病（Porcine pseudorabies,PR）变异毒株在我国多个省份暴发,本实验室分离鉴定了伪狂犬病病毒变异毒株（PRV-HNX株）。临床上PRV、PCV3常混合感染,使疾病更加复杂和难以诊断,因此研制出一种可以同时预防PCV3和PRV的疫苗尤为重要。为此,本研究开展了以下的工作:1.表达PCV3-Cap蛋白的重组伪狂犬病病毒（HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2）的构建与鉴定首先构建了靶向伪狂犬病病毒TK基因的sg RNA重组质粒TK-sg RNA-PX458和重组质粒m Cherry-p UC19。将前期构建g E基因缺失毒株（PRV-HNX-（35）g E）基因组、TK-sg RNA-PX458和m Cherry-p UC19重组质粒共转染HEK 293T细胞,挑取具有红色荧光空斑,并进行空斑纯化和PCR验证,成功获得HNX-（35）TK/（35）g E-m Cherry重组病毒。再将HNX-（35）TK/（35）g E-m Cherry基因组与m Cherry-sg RNA-PX458、PCV3-Cap-p UC19重组质粒共转染HEK 293T细胞,反向挑取不发荧光的空斑、并进行纯化,获得插入PCV3 ORF2基因的重组病毒,命名为HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2。PCR结果表明,HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2重组病毒纯化完全;蛋白免疫印迹、间接免疫荧光结果显示,HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2重组病毒成功表达PCV3-Cap蛋白;病毒一步生长曲线表明,HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2重组病毒与其亲本毒株PRV-HNX相比,生长特性无明显差异。2.HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2重组病毒的安全性评价将DMEM、PRV-HNX、HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2分别接种6周龄的BALB/C小鼠。q PCR结果显示,在PRV-HNX接种组小鼠的脑、脾、肾中检出了PRV DNA,而未在HNX-（35）TK/（35）g E和HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种组小鼠组织中检出PRV DNA;ELISA结果显示,接种后第4天,HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种小鼠血浆中白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）含量分别为35.00?14.19pg/m L和30.40?17.18pg/m L,粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF）含量分别为375.43?113.28pg/m L和392.40?191.53pg/m L,两组之间无显著性差异（P>0.05）,但显著低于PRV-HNX接种小鼠血浆中IL-6（353.89?75.88pg/m L）和G-CSF（7229.25?1042.38pg/m L）的含量（P<0.01）;RT-q PCR结果显示,PRV-HNX、HNX-（35）TK/（35）g E和HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种组小鼠脑中IL-6分别是DMEM对照组的7.35?1.96倍、1.63?0.44倍和1.64?1.02倍,G-CSF是DMEM对照组的82.30?25.00倍、2.03?1.64倍和1.62?0.52倍,可见HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2两组之间IL-6和G-CSF无显著性差异（P>0.05）,但显著低于PRV-HNX接种小鼠脑中IL-6和G-CSF的相对表达量（P<0.01）;PRV-HNX接种组小鼠6天内全部死亡,而HNX-（35）TK/（35）g E和HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种组的小鼠,在观察期内无小鼠死亡,无瘙痒、被毛蓬乱等症状,表明即使插入PCV3 ORF2基因后,该重组病毒仍保持良好的安全性,刺激产生炎性相关因子的能力没有差异。3.HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2重组病毒免疫原性研究将DMEM、HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种6周龄的BALB/C小鼠。3天后,眼球采血1m L。提取血液中的细胞,加入PE anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD8a、APC/cyamine7 anti-mouse CD69抗体,暗室孵育30min,运用流式细胞仪分析。结果显示,DMEM、HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种组小鼠外周淋巴血中CD3+T细胞分别为19.42?1.75%、38.98?0.97%、35.78?2.65%,CD3+CD4+T细胞分别为42.35?2.98%、56.23?2.01%、56.60?2.51%,CD3+CD8+T细胞分别为13.84?0.42%、15.71?2.55%、15.25?2.62%;CD3+CD69+T细胞分别为2.48?0.94%、18.02?1.86%、17.00?0.90%,CD4+CD69+T细胞分别为0.78?0.47%、3.21?0.74%、2.91?0.90%,CD8+CD69+T细胞分别为1.68?1.64%、13.67?4.25%、13.06?3.47%。结果表明,HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2与HNX-（35）TK/（35）g E均能有效刺激细胞免疫应答,且两者差异不显著。将DMEM、HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2接种6周龄的BALB/C小鼠,14天之后加强免疫一次。免疫后每周采取小鼠尾静脉血,取血清。阻断ELISA结果显示该重组病毒能有效诱导小鼠产生PRV-g B抗体。间接ELISA、IFA和IHC结果显示,该重组病毒能诱导小鼠产生PCV3-Cap特异性抗体,该抗体可识别表达PCV3-Cap蛋白的Sf-9细胞、PCV3感染的PK-15细胞以及PCV3感染猪的肺脏和淋巴结组织中的PCV3抗原。4.重组病毒对PRV-HNX感染小鼠的保护试验免疫后35天,各组经后肢足垫部接种PRV-HNX野毒。可观察到,DMEM对照组小鼠,在接种后第三天开始出现瘙痒、被毛蓬乱,边转圈边咬后肢注射部位的现象,7天内小鼠全部死亡。HNX-（35）TK/（35）g E和HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2免疫组的小鼠在观察期内均无小鼠死亡。DMEM对照组小鼠大脑局部出现血管周淋巴细胞浸润,形成血管袖套;在大脑皮质下出现淋巴细胞和小胶质细胞增生,在局部区域形成结节;在脑内可见弥散性神经细胞染色加深、变性,出现噬神经现象。而HNX-（35）TK/（35）g E、HNX-（35）TK/（35）g E-ORF2免疫组脑组织无明显病理变化。这表明,表达PCV3-Cap后,重组病毒不改变其对伪狂犬病病毒的免疫效力。综上所述,本研究首次构建了表达PCV3-Cap蛋白的PRV重组病毒,小鼠试验证实了该重组病毒的安全性,并可激活细胞免疫反应,诱导机体产生PCV3-Cap特异性抗体,为预防PR和PCV3相关疾病奠定了基础。