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研究背景:蚊虫传播的病毒性疾病(Mosquito-borne viral diseases,MBVDs)对全球公共卫生构成了严重威胁,严重危害人类生命健康,影响社会的稳定。蚊虫防制仍然是综合蚊虫管理(Integrate mosquito management,IMM)计划中的核心干预策略,以减少MBVDs的传播。传统的化学农药是目前使用最频繁和最广泛的控制蚊虫的方法,然而,化学农药对生态系统造成了严重的负面影响,蚊虫也出现了杀虫剂抗性(Insecticide resistance,IR)问题,这使得开发新的蚊虫防制方法至关重要。而生物杀虫剂的研究与应用将为蚊虫的防制提供新的策略。生物防制主要应用蚊虫真菌,细菌、病毒等病原体、天敌等来达到防治效果,对非靶标生物和有益生物无毒害,不危害生态系统,蚊虫对其不易产生抗性。蚊浓核病毒(Mosquitodensovirus,MDVs)属于蚊虫特异性病毒,特异性感染蚊类,可以在自然界中垂直传播和水平传播。高滴度病毒可以直接杀伤蚊类,低滴度可以影响蚊类寿命、产卵量、孵化率等,从而降低媒介种群数量。目前多种MDVs的全基因组己经成功构建为感染性克隆质粒载体,便于进行基因改造使其成为很好的基因转移载体和基因表达载体。因此,对MDVs进行分离和鉴定,分析MDVs的分子生物学和病原性特点,将为发展MDVs为生物杀虫剂和基因表达载体提供理论基础,为发展生物杀虫剂提供更多可替代的选择。目的:对野外白纹伊蚊(Aedes albopictuds)成蚊中分离出的一株蚊浓核病毒(Aedes albopictus densovirus-7,AalDV-7)进行鉴定,对其全基因组、转录本、蛋白进行分析,实验室初步测试该病毒对白纹伊蚊、埃及伊蚊(Aedesaegypti)和致倦库蚊(Culexququefasciatus)的幼虫的病原性,为发展MDVs为生物杀虫剂和基因表达载体提供理论基础。方法:通过超速密度梯度离心的方法,从广东省广州市野外采集的白纹伊蚊体内成功分离一株蚊浓核病毒,并将其命名为白纹伊蚊浓核病毒-7(AalDV-7)。我们通过克隆、测序分析了AalDV-7的基因组特征,并对三个开放阅读框(ORF)的转录和翻译进行了分析。利用重组载体和野生病毒共转染细胞获得重组病毒感染幼虫后观察重组病毒在蚊幼虫体内的入侵部位和扩散。将登革热和寨卡病毒的主要媒介白纹伊蚊、埃及伊蚊和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)媒介致倦库蚊的幼虫暴露于 1.00×10s、1.00×109、1.00×l010、1.00×1011geq/ml剂量梯度的病毒液中感染24 h后,每24 h记录幼虫的生存情况,以分析AalDV-7的病原性。另外,评估了 1.00×108geq/ml病毒浓度下,AalDV-7在宿主体内的感染率和病毒相对滴度,以探究其对蚊虫防制的潜力。结果:经过克隆和测序,AaIDV-7的完整序列己提交GeneBank(GeneBank:MK182384)。AalDV-7的基因组完整基因组长4,048 nt,含三个重叠的ORFs。SDS-PAGE证明其可编码NS 1蛋白、VP蛋白。经RACE实验,VP的转录起始位点(Transcription initiation site,TIS)位于ATG上游 158 nt或 1 nt,NS1/NS2基因的TIS位于ATG上游6 nt而NS1和NS2基因共享一个TIS位点。NS与VP基因享有一个共同的转录终止位点(Transcription termination sites,TTS),位于VP基因翻译终止位点后60 nt。系统进化树分析表明,AalDV-7与MDVs聚类,其中大多数是从成蚊中分离出来的。AalDV-7感染伊蚊的初始部位主要为肛门乳头,第二常见部位是毛细胞基部,其次是肛门乳头基础部。感染致倦库蚊的初始部位仅出现在肛门乳头。重组病毒可分布于幼虫全身,包括前肠,中肠,后肠,肌肉组织等。AalDV-7对三种蚊虫的致病性差异显著,当白纹伊蚊的幼虫暴露于1.00×Il010geq/ml的病毒液24h后,死亡率大于50%,LD50为109.48 geq/ml。暴露于1011ugeq/ml的病毒液24h后,死亡率为82%,LT50为7.72d。与埃及伊蚊和致倦库蚊相比,具有最低的半数致死浓度(Median lethal dose,LD50)和较短的半数致死时间(Median lethal time,LT50)。亚致死效应分析还表明,AalDV-7感染可降低化蛹率和羽化率。三种蚊虫1-2龄幼虫均表现出100%的感染率,在致倦库蚊的1-2龄幼虫中观察到最高的相对滴度。结论:AalDV-7对三种蚊虫的致病性差异显著。AalDV-7对白纹伊蚊致病性强,有望作为生物杀虫剂应用于蚊媒防制。另外,AalDV-7感染致倦库蚊后,有很高的感染率和病毒滴度,但对其致死性很弱,这使得AalDV-7有望成为致倦库蚊体内的基因表达载体,用于基因功能的研究。总之,对MDVs进行分离和鉴定,分析MDVs的分子生物学和病原学特征,丰富了蚊虫病原体病毒的资源,将为生物杀虫剂的发展提供更多的选择。