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目的： 恶性肿瘤逃避机体免疫监视和产生免疫耐受的重要原因之一，是肿瘤细胞能抑制肿瘤微环境中免疫杀伤细胞的功能。PD-1是主要表达于肿瘤浸润性淋巴细胞CTL表面的免疫抑制性受体，它与表达于肿瘤细胞表面的配体PD-L1结合后，将诱导CTL分泌免疫抑制性细胞因子并导致其发生凋亡，由此失去杀伤肿瘤的作用。此外，明胶酶作为肿瘤细胞分泌的特异性蛋白水解酶，能够降解细胞外基质和内皮下基底膜，促进肿瘤侵袭和转移。因此，若能同时阻断PD-1/PD-L1信号转导途径并抑制明胶酶活性，可望能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移。本研究的目的是设计和制备一种融合蛋白dFV-ePD1，它由能抑制明胶酶活性的单链抗体的可变区片段ScFV和能阻断PD-1/PD-L1相互作用的PD-1胞外段连接而成，随后测定融合蛋白dFV-ePD1对小鼠黑色素瘤细胞B16-F1的靶向结合能力及其对B16-F1生长和侵袭迁移的抑制作用。 方法： 利用基因工程技术构建重组质粒pET30a(+)/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV，将上述质粒转化原核表达菌后，IPTG诱导带有His-tag的目的重组蛋白（dFV-ePD1和dFV）表达并用镍柱亲和层析法纯化。明胶酶谱法检测复性后的融合蛋白对明胶酶活性的抑制作用，细胞免疫荧光和免疫组化法分别检测重组蛋白与黑色素瘤细胞及临床组织芯片黑色素瘤组织的结合能力；流式细胞术分析重组蛋白对黑色素瘤的亲和力；MTT、细胞划痕实验和Transwell分别检测重组融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞体外增殖和侵袭迁移的抑制作用。 结果： （1）成功构建pET30a(+)/dFV-ePD1和pET30a(+)/dFV原核表达质粒，并在E.coli中表达和纯化出融合蛋白； （2）复性后的融合蛋白dFV-ePD1能抑制明胶酶活性，其对明胶酶的抑制作用随蛋白浓度升高而增强； （3）dFV-ePD1融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞和人黑色素瘤组织芯片均有较高的结合活性； （4）dFV-ePD1融合蛋白能抑制小鼠黑色素瘤细胞的增殖； （5）融合蛋白dFV-ePD1能抑制小鼠黑色素瘤细胞细胞侵袭与迁移。 结论： 成功制备了基于抗明胶酶单链抗体和靶向PD-L1的双靶点特异性融合蛋白dFV-ePD1，该融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞具有很好的亲和力和体外增殖迁移抑制作用，具有用于临床抗肿瘤免疫治疗的潜在价值。