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雪莲属菊科(Compositae)凤毛菊属(Saussurea DC.)植物。雪莲种类较多,其中最常用的有新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)和水母雪莲(Saussurea medusa),是我国名贵中药材,用于治疗风寒湿痹、风湿性关节炎、妇女月经不调等。
新疆雪莲的主要药用活性成分为类黄酮化合物,主要来自于野生雪莲资源。然而,在多数情况下其产量不能满足商业开发的需求,因此采用代谢工程提高其中的特定成分含量是解决此问题的有效手段之一。本研究在对水母雪莲类黄酮代谢途径中的第一个限速酶--查尔酮合酶基因(SmCHS)进行功能鉴定的基础上,进一步利用原核表达的方式以及利用在模式植物烟草中的表达对SmCHS基因进行功能鉴定与分析,并通过基因工程手段利用根癌农杆菌将SmCHS导入新疆雪莲胚性愈伤组织,产生转基因新疆雪莲组培苗,以期提高新疆雪莲的类黄酮物质含量,进行新疆雪莲类黄酮物质的生产。主要结果如下:
1.对克隆到的水母雪莲查尔酮合酶基因SmCHS进行原核表达。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮,SmCHS是一个有功能的基因。
2.根癌农杆菌介导法将SmCHS基因导入烟草,对烟草进行总黄酮含量测定,结果显示两个株系的转基因烟草的总黄酮含量均高于对照株系。
3.根癌农杆菌介导法将SmCHS基因导入新疆雪莲,得到转基因新疆雪莲组培苗。