论文部分内容阅读
猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种常见的致病菌，给养猪业带来较大的损失。目前对猪链球菌主要选择抗生素进行治疗，但是由于抗生素的不规范使用，使猪链球菌耐药现象严重，治疗效果较差。清热解毒类中药具有清热、泻火、凉血、解毒等作用，而且具有高效低毒、不容易产生耐药性和有害残留等优点。本试验将实验室保存的保定株(BD1)和秦皇岛株(QHD1)两株猪链球菌进行培养，革兰氏染色观察，细菌形态为短链状、椭圆形的结构。DNA提取并经16S rDNA测序鉴定，确定两株菌均为猪链球菌2型。采用动物致病性试验筛选合适菌株，结果显示BD1和QHD1两菌接种昆明小鼠后不发病，处死后也未见内脏病理变化。两菌株肌肉注射接种仔猪，BD1组猪体温最高达40℃，QHD1为39.8℃。血常规检测发现白细胞显著增加，并且引起精神状态先沉郁后好转。BD1组后肢关节肿大及典型的间质性肺炎或纤维素性肺炎，提示BD1细菌致病性高于QHD1，故选择BD1进行后续试验。打孔法和试管二倍稀释法体外抑菌试验结果检出，黄连等42种中药中有29种对猪链球菌有一定的抑菌作用，其中黄连水提物的抗菌活性最强，MIC与MBC均为0.98mg/mL。通过活菌计数法绘制最佳抑菌曲线，得出在BD1培养1h时，细菌生长速率最快，在此时将终浓度为1/2MIC(0.49mg/mL)浓度黄连作用细菌，在培养1h后可以杀死90％细菌。将药物作用前后编号分别为S.suis_0和S.suis_1的菌株进行转录组测序，对S.suis_0与S.suis_1之间的差异基因进行GO功能和KEGG通路以及IPR功能富集分析。结果发现黄连作用前后共有30个基因的表达量发生显著变化，其中23个基因表达量上调，7个基因表达量下调，并随机选取了10个基因进行了实时荧光PCR验证。与细菌能量利用有关的半乳糖异构酶(GPI)和核糖-5-磷酸异构酶B(RpiB)表达下调，磷酸酶转移系统(PTS)系统表达下调。乳糖操纵子(lac)阻遏蛋白表达上调，与细菌突变有关的ClpP蛋白酶表达上调，转座酶(TnpA)和噬菌体λ表达上调。Ⅰ型限制性内切酶中HsdS表达下调，与细胞壁和细胞膜有关的D型氨基酸酰基脂磷壁酸(dltA)表达下调，MFS和ABC转运系统表达下调。结果提示，黄连主要是通过使细菌能量摄取系统表达受阻，细胞壁和细胞膜屏障作用减弱，突变几率增加来发挥抑菌作用。本研究通过转录组测序分析对清热解毒类中药体外抗菌机制进行了初步探讨，为临床防治猪链球菌病中药方剂的筛选提供参考依据。