水禽禽流感分离株毒力特性及其HA序列的分析与比较

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本研究从2000年到2002年期间我国部分地区在水禽中流行的H5亚型禽流感毒株中选取了13株鹅、鸭源分离株和1株鹌鹑分离株进行了毒力特性和HA基因序列的研究。 选取了6株鹅源分离株WZ2001、SZ2001、JD2001、WJ2001、SH2000和WJ2000,通过静脉接种35日龄无H5亚型抗体的荣昌鹅,死亡率从20%到100%不等,将这6个毒株分为三个等级:WZ2001的致死率达到100%,SZ2001的致死率达到80%,对鹅的毒力最强;JD2001和WJ2001其次,致死率为66.7%和60%;SH2000致死率为40%,WJ2000致死率仅为20%,对鹅的毒力最弱。观察它们的细胞病变发现各有差异,36小时后WJ2001株在CEF的病变最明显,SH2000株相对较弱。 提取这14个毒株的基因组RNA,利用RT-PCR技术成功的提取它们的基因组RNA,利用RT-PCR技术成功扩增出与预期的1.7kb大小相符合的HA基因特异条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM~R-T载体,进一步进行了序列测定。序列分析表明所扩增的14个毒株HA基因片段长度均为1732bp,包含的完整阅读框架长度为1707bp,共编码568个氨基酸。14个毒株HA裂解位点处均具有多个碱性氨基酸,序列为RIRKKR(WZ2001)、RRRKRR(WJ2001、SZ2001和AN2001 3株)、RRRKKR(其余10株)三种不同的类型,从分子水平显示这14个毒株是高致病力毒株。序列同源性分析结果显示,这14个毒株之间HA基因氨基酸的同源率为96.3%到99.1%。它们与国内早期H5N1亚型分离株GD96、HK97和欧洲代表株IRE83,北美代表株PA83的HA基因氨基酸同源率分别为GD96 96.1%-97.9%,HK97 95.1%-96.8%,IRE83 89.1%-90.9%,PA83 84.6%-86.3%同源性依次降低,说明广阔的地域和长时间分布是病毒流行分布的主要趋势。 比较这14个HPAIV的HA基因上的重要位点:裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点发现,其裂解位点和受体结合位点大致相同,WJ2002株在301,511位点,AN2001在757位点处出现了两个潜在的糖基化位点,JD2001在469位点处出现了潜在的糖基化位点,SH2001和DTZool在628位点处有一个糖基化位点消失。 以HA基因编码区序列为基元,对本文所做的14个毒株构建HS亚型月v分离株的遗传发生树。结果表明除WZ2001独立形成一支外,其余13株按分离的时间不同可明显的分成两个分支,而非水禽分离株与和它同期分离的几个Alv毒株不在同一分支上,而是同后期分离的几个毒株同源性较高。由此可提示我们在病毒流行中可能出现这种情况:鹅、鸭,非水禽(如鹤鹑)竺知水禽,而造成在水禽中AI的再次流行。
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