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发光细菌能够通过自身携带的lux CDABE基因簇编码合成荧光素酶及其相应的发光底物而产生独特的光信号。Lux CDABE基因由于其自发荧光背景低、非破坏、易于检测等优点,已被作为报告基因用于食品和环境中各种微生物的模型研究中。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种条件致病菌,因其具有极强的环境适应性,较快的分裂速度,对生长环境(营养、湿度等)的要求较低,在环境中广泛分布,会导致食品腐败或引起人体中毒等安全问题。本研究利用来源于发光光杆状菌(Photobacterium luminescens)的lux CDABE基因簇,构建了重组发光铜绿假单胞菌,之后对其发光特性、抑菌评估和生物膜形成机理的探究展开研究,具体研究结果如下:(1)本研究基于发光光杆状菌的lux CDABE基因,构建了两株可成功表达生物发光的重组发光铜绿假单胞菌:PAO1-CE和PA27853-CE。这两种重组发光铜绿假单胞菌发光的最适温度为37℃,p H为7.0,Na Cl浓度为1.0 mg/m L。两种重组发光铜绿假单胞菌的发光表达量传代稳定,且室温条件下发光稳定。PAO1-CE的发光表达量约为PA27853-CE的5倍,故选择PAO1-CE进行后续研究。(2)以PAO1-CE为工具,建立了铜绿假单胞菌敏感抑菌物质的定量检测Str、Car的模型为指数模型:y=96.1138(1-e(-0.1393x))和y=95.2735(1-e(-0.1362x))(敏感范围依次为:1.00～50.00μg/m L,1.00～47.50μg/m L);Amp、Ter、Tmp和Cip的定量检测数学模型为线性模型:y=42.8581+0.0283x,y=41.7624+0.5885x,y=14.311+0.436x,y=2.0228+137.28x(线性范围依次为:56.25～1800.00μg/m L,6.75～100.00μg/m L,500.00～2000.00μg/m L,0.05～0.7μg/m L);除Amp外,各拟合模型的决定系数R~2均大于0.98。通过MIC、生长模型参数、ATP水平、AKP酶活、细胞内/外膜通透性、细胞膜完整性和FESEM测定Str、Car、Amp、Ter、Tmp和Cip对铜绿假单胞菌的抑菌作用,得出六种抗生素对铜绿假单胞菌的正常代谢,细胞膜和细胞壁完整性均有影响,PAO1-CE可用作快速和灵敏的检测工具,用于评估铜绿假单胞菌对新型抗菌化合物的敏感性。(3)利用PAO1-CE定量评价了SAN和EGN对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果显示:PAO1-CE定量检测SAN和EGN数学模型分别为y=11.3398+0.5822x(R~2=0.9321)和y=17.856+0.5862x(R~2=0.9665),这表明SAN和EGN对铜绿假单胞菌的毒性作用与作用浓度密切相关,证实了PAO1-CE用于定量评估某种物质对铜绿假单胞菌的细胞毒性作用的可行性。通过进一步探究SAN和EGN的抑菌机理,得出SAN抑制铜绿假单胞菌是通过破坏其细胞膜完整性;EGN虽然可以改变铜绿假单胞菌的细胞内膜和细胞外膜的通透性,但是它对菌体细胞膜完整性产生的损害较SAN小。两种纳米微粒对铜绿假单胞菌有良好的抑制作用。(4)通过测定不同培养基种类(LB/TSB/M9),不同温度(25℃/37℃)和不同接种浓度(10~6/10~7/10~8 CFU/m L)下铜绿假单胞菌的生物形成量,得出铜绿假单胞菌生物膜定量模型培养条件:LB培养基,接种浓度为10~6 CFU/m L,37℃条件下培养3 d和7 d,用结晶紫法测定生物膜形成量。在优化后的建模条件下,六种抗生素和两种纳米微粒在其1/2 SICs和SICs作用浓度下均显示出对铜绿假单胞菌生物膜形成的有效抑制。银染法和FESEM观测结果从外观上验证了各种物质的抑制铜绿假单胞菌生物膜形成能力。以结晶紫染色法为依据,得出八种物质中抑膜效果最好的为Str和Car,选取这两种抗生素继续探究发光抑制率和生物膜形成量之间的数量关系和对铜绿假单胞菌的抑膜机理展开研究。(5)在作用浓度范围为0～14μg/m L时,利用IR%预测Str作用3 d和7 d的生物膜形成量模型公式分别为:y=-0.0412x+3.0817(R~2=0.8874)和y=-0.0265x+1.4294(R~2=0.9072);Car作用3 d和7 d的生物膜形成量模型公式分别为:y=-0.0538x+3.3640(R~2=0.8972)和y=-0.0202x+1.1796(R~2=0.8667),结果表明该预测模型的可信度较高。利用6种特异性启动子-报道子测定和RTq-PCR验证得出,Str和Car可通过抑制胞外多糖合成基因psl M/pel A/alg A/bdl A/ppy R的表达降低铜绿假单胞菌生物膜的形成量。因此,Str和Car抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的机理为抑制其胞外多糖Psl和Pel的形成量、改变细菌趋化性、弹性蛋白酶活性和细菌的丛动及泳动。