论文部分内容阅读
目的：
1、研究重组创伤弧菌溶细胞素(recombinantVibriovulnificushemolysin，rVvhA)对人单核细胞白血病细胞(THP-1)的细胞毒性作用。
2、研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)对人单核细胞白血病(THP-1)细胞内Ca2+浓度的影响并了解其机制。
3、为进一步了解和明确创伤弧菌溶细胞素(Vibriovulnificushemolysin，rVvhA)的分子致病机制研究提供科学依据。
方法：
1、IPTG诱导含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌表达创伤弧菌溶细胞素融合蛋白rVvhA，SDS-PAGE分析其表达产物。其中以包涵体形式表达的蛋白质用三步洗涤结合Ni2+亲和层析法对rVvhA进行纯化，纯化后采用复性液与分步透析相结合的方法复性蛋白质。活性rVvhA冷冻干燥成粉末于-70℃保存。
2、不同浓度活性rVvhA作用THP-1，CCK-8法检测rVvhA对THP-1细胞生长的抑制作用；普通光学显微镜观察细胞的形态变化；激光扫描共聚焦显微镜结合Fluo-3AM钙离子荧光探针测定rVvhA作用THP-1细胞瞬间胞内钙离子浓度变化，并检测细胞外钙离子螯合剂(EGTA)和细胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM)对胞内钙离子浓度变化的影响；AnnexinV-FITC/PI标记法结合流式细胞仪检测THP-1细胞凋亡及坏死的情况，并检测EGTA和BAPTA/AM对THP-1细胞凋亡及坏死的影响。
结果：
1、含pET-28a(+)vvhA重组质粒的BL21大肠杆菌经0.5mmol/LIPTG诱导后表达的融合蛋白Mr约为54kDa，SDS-PAGE结果与该融合蛋白的理论推算值相符，表达的蛋白质经三步洗涤后，再经Ni2+-NTA柱纯化，其纯度达93％左右。纯化后样品经复性后证明具有溶血活性，溶血活性为0.2mg蛋白/HU。
2、CCK-8实验结果表明，rVvhA活性蛋白能显著降低THP-1细胞的存活率，并呈现剂量依赖性。0.7HU/mlrVvhA的抑制率是59.87％。rVvhA作用后细胞内钙离子浓度瞬间明显增加，细胞分别经胞外钙离子螯合剂(EGTA)和胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM)处理后，BAPTA/AM处理组细胞内钙离子荧光强度升高幅度较EGTA处理组明显增高。流式细胞仪测定结果可见0.3HU/ml和0.5HU/mlrVvhA可分别诱导THP-1细胞发生明显凋亡，凋亡率分别为(4.583±0.467)％和(9.400±2.374)％。0.7HU/mlrVvhA可诱导THP-1细胞发生明显坏死。EGTA和BAPTA/AM不抑制rVvhA诱导的细胞凋亡。
结论：
rVvhA对THP-1有细胞毒性作用，抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性；rVvhA作用THP-1细胞后可引起细胞内钙离子浓度瞬间明显升高，且升高的钙离子可能主要源于细胞外钙离子内流；rVvhA可以诱导THP-1细胞发生凋亡和坏死，细胞外钙离子螯合剂EGTA和细胞内钙离子螯合剂BAPTA/AM不抑制rVvhA诱导的THP-1细胞凋亡。