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碱性氨基酸转运载体功能担负着碱性氨基酸在细胞膜上的跨膜运输功能。其中,转运系统b0,+和y+L和y+系统担负着大部分碱性氨基酸的转运任务;对于猪来说,碱性氨基酸转运系统的功能研究尚属一个全新的领域,而其cDNA的全序克隆是认识这一全新领域的必要基础。为研究猪碱性氨基酸吸收的分子机制及调控,本论文开展了以下五个试验。试验一进行了猪碱性氨基酸转运载体rBAT、4F2hc的cDNA序列电子克隆及序列验证。利用NCBI上已经公布的人4F2hc、rBAT的cDNA序列,检索EST(None Human & Mouse)数据库获得猪的若干EST序列,利用生物信息学软件分析以后电子克隆得出4F2hc、rBAT的全部或者部分序列。并据此设计引物通过RT-PCR来验证其部分序列。结果表明:(1)猪rBAT的cDNA全长2487bp,其中包含一段5’和3’UTR,CDS长2049 bp,和人rBAT同源性为77.4%,编码区同源性达85.7%,推测蛋白的同源性高达87%。(2)克隆到猪4F2hc cDNA长度为1730bp的部分片段,与人4F2hc cDNA序列进行同源性比较分析发现,同源性为80.2%。(3)通过RT-PCR的方法进行了部分序列的验证,结果表明,电子克隆的序列基本可靠,测序序列和电子克隆序列同源性高达98.4%,99.4%,99.5%和98.2%。试验二进行了猪碱性氨基酸转运载体b0,+AT、y+LAT1基因的cDNA克隆。根据GenBank中的公布序列或EST序列设计引物,采用RACE的方法,以6日龄长白猪肠道组织mRNA为模板,克隆了b0,+AT、y+LAT1的cDNA序列。结果表明:(1)猪b0,+AT-1的cDNA全长1680bp,包含一个1464bp的ORF,编码487个氨基酸残基。5’ UTR长90bp,3’ UTR长126 bp。b0,+AT-2的cDNA全长1488bp,包含一个1272bp的ORF,编码423个氨基酸残基。在polyA尾上游7–12 nt有一个AATAAA的加尾信号序列。b0,+AT-2在编码区比b0,+AT-1少192bp,少编码64个氨基酸残基。序列分析显示b0,+AT-2和人b0,+AT、小鼠b0,+AT以及猪b0,+AT-1编码区序列的同源性分别高达75.1%、71.9%和86.6%。(2)猪y+LAT1 cDNA全长2111 bp,包含一个1536bp的ORF,编码511个氨基酸残基。5’ UTR长134bp,3’ UTR长441 bp,在polyA尾上游15–20 nt有一个AATAAA的加尾信号序列。序列分析显示其和小牛、人、小鼠、大鼠y+LAT1 cDNA具有高度的同源性,尤其CDS区的同源性分别高达91%,90%,87%和87%;编码蛋白的同源性分别为93.2%、92.4%、88.5%和88.9%。试验三研究了猪肠道碱性氨基酸转运载体rBAT和4F2hc mRNA表达的发育模式。分别采集1、7、26、30、60、90和150日龄的蓝塘和长白两品种猪十二指肠、空肠和回肠组织样品,采用实时荧光定量PCR方法,检测猪rBAT及4F2hc在不同肠段中的表达模式。结果表明:(1)蓝塘和长白猪十二指肠、空肠和回肠rBAT和4F2hc mRNA表达的发育性变化随肠段、时间、品种的不同而呈现差异。断奶前(28d断奶)后rBAT和4F2hc mRNA的表达丰度不受影响。(2)蓝塘和长白猪十二指肠和空肠的4F2hc mRNA表达模式比较相似。蓝塘猪在7d表达丰度最高,长白猪在60d表达丰度达到顶峰。(3)蓝塘和长白猪十二指肠、空肠和回肠rBAT和4F2hc mRNA表达的发育性变化分别和其轻链b0,+AT和y+LAT1的mRNA表达相比,表达各有不同,没有线性关系。试验四研究了猪碱性氨基酸转运载体b0,+AT、y+LAT1、rBAT和4F2hc基因mRNA表达的组织特异性。采集初生杂交仔猪心、肝、肺、肠、肾、脑和肌肉组织样品,提取组织样品的总RNA并进行反转录;用实时荧光定量PCR方法,检测猪b0,+AT、y+LAT1、rBAT和4F2hc在不同组织中的表达丰度。结果表明:(1)猪4F2hc mRNA在脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心脏都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在脑和肺组织,在肝、肾、肌肉、心脏等组织的表达量比较低。(2)猪rBAT mRNA在脑、肺、肝、肾、肌肉、肠都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在脑、肌肉和肾组织,在肝、肺等组织的表达量比较低。在心脏组织中表达更低,几乎没有可以检测的表达。(3)猪b0,+AT mRNA在肾、肌肉、肠和心脏都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在肾和心组织,在肌肉组织的表达量比较低。而在肝、肺、脑组织中几乎没有可以检测的表达。(4)y+LAT1 mRNA在肾、肺、肠和心脏都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在心脏组织,在肾和肺组织的表达量比较低。而在肝、肌肉、脑组织中几乎没有可以检测的表达。试验五通过建立猪肠上皮细胞原代培养的方法,研究了赖氨酸对体外培养的猪小肠粘膜上皮细胞碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响。采用刚出生(未吮乳)的仔猪小肠组织,用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法,成功地在体外培养了新生仔猪IEC;在DMEM–F12培养基中,细胞在1~2d内贴壁,5~6d形成细胞克隆,9-11d融合成片;经碱性磷酸酶与免疫细胞化学鉴定为阳性细胞。分别用浓度为0.5 mM、2mM、8mM赖氨酸处理细胞96小时,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法,检测碱性氨基酸转运载体在不同处理细胞中的表达丰度。结果表明:(1)高浓度的赖氨酸对CAT-1 mRNA的表达均有上调作用,差异极显著(P<0.01),并且呈剂量依赖效应。(2)不同浓度的赖氨酸对CAT-2 mRNA的表达影响不大,8mM和2mM赖氨酸组CAT-2 mRNA的表达丰度均有低于0.5mM的趋势,但二者之间差异不显著(P>0.05);(3)不同浓度的赖氨酸对y+LAT1 mRNA表达影响差异不显著(P>0.05)。(4)高浓度的赖氨酸可提高4F2hc mRNA的表达。0.5mM和2mM赖氨酸组4F2hc mRNA的表达丰度均低于8mM,且差异显著(P<0.05),0.5mM和2mM赖氨酸组之间差异不显著(P>0.05)。