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肿瘤免疫治疗通过调动患者自身的免疫系统来杀伤肿瘤以达到治疗肿瘤的目的,是肿瘤治疗领域的研究热点。机体的抗肿瘤免疫效应主要是由T淋巴细胞(CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+Ⅰ型辅助T细胞)介导的适应性免疫应答。但是,“肿瘤微环境”的存在和肿瘤自身的低免疫源性不仅会导致肿瘤患者体内CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+型辅助T细胞存在活化障碍。另外,这两种细胞的功能在肿瘤微环境中还会被强烈抑制,这是肿瘤免疫治疗的主要障碍之一,因此,探究和阐明CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+ Ⅰ型辅助T细胞活化过程中的调控机制,对肿瘤免疫治疗的研究具有重要意义。同时,肿瘤微环境中还存在多种浸润的免疫抑制细胞(髓源抑制性细胞、肿瘤相关巨噬细胞及肿瘤相关调节性T细胞),根据这些免疫抑制细胞的作用机制,设计筛选具有代表性的化合物来重塑这些细胞的表型和功能用以唤醒肿瘤患者自身的抗肿瘤免疫,可为肿瘤免疫治疗寻找到重要的候选药物。MiR-21具有广泛的细胞功能调节作用,在本论文的研究中,我们首先探究了全身性敲除microRNA-21小鼠对异体移植瘤生长的影响。利用S180和Heps两种异体瘤肿瘤模型,我们首先观察到miR-21敲除能够显著促进两种异体瘤的生长,同时,CD4+T细胞和CD8+T细胞在miR-21-/-荷瘤小鼠外周血、脾脏及肿瘤部位的比例显著下降,并且二者在肿瘤部位分泌IFN-γ的量也明显降低。接下来,我们向miR-21-/-小鼠输送野生型T细胞发现其能够恢复miR-21-/-小鼠的抗肿瘤能力,这些结果说明miR-21敲除促进异体瘤的生长是由于T细胞活化障碍引起T细胞介导的抗肿瘤免疫应答低下导致的。我们发现在正常情况下(未免疫刺激),miR-21敲除并不影响髓系来源细胞的平衡。一旦受到免疫刺激,体内和体外实验结果均显示miR-21缺失能够抑制T细胞的增殖和功能,但不影响其凋亡。接下来,我们对miR-21对T细胞增殖与功能调控的分子机理进行探究。我们发现miR-21是通过其靶点PTEN抑制PI3K/Akt信号通路来调节T细胞的增殖和功能。为进一步验证这一点,我们在miR-21-/-CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中重建miR-21的表达或者干扰PTEN蛋白的表达,发现二者都能够通过降低PTEN的蛋白水平上调Akt磷酸化水平来恢复T细胞的增殖和功能。综上,这部分研究显示miR-21缺失会导致T细胞免疫应答缺陷,继而导致异体瘤生长加速,其后的miR-21调控T细胞增殖与功能的分子机制研究,为基于T细胞的肿瘤浸润淋巴细胞过继免疫细胞治疗提供重要的研究参考,同时,结合前人有关的miR-21促进肿瘤细胞增殖的研究结果,本研究揭示了 miR-21在肿瘤的发生发展过程中可能具有双向的、动态的调控作用。一些大分子聚合物如阳离子聚合物具有免疫活化功能,能够引起机体稳定的免疫应答。本实验室之前的研究证明阳离子聚合物(阳离子化葡聚糖(C-dextran)和聚醚酰亚胺(PEI))是TLR-4的配体,并可激活巨噬细胞的免疫反应。髓源免疫抑制性细胞(MDSCs)是肿瘤微环境中重要的免疫抑制细胞,能够有效抑制T细胞的抗肿瘤免疫效应,促进肿瘤的生长,严重阻碍了肿瘤免疫治疗的效果。有研究表明,MDSCs表达TLR-4受体,并且LPS和IFN-γ能够诱导MDSCs向M1型MDSCs分化,产生抗肿瘤效应。因此,阳离子聚合物也有可能够通过TLR-4受体来影响MDSCs的极化,从而发挥抗肿瘤效应。在这一部分研究中,我们首先证明,在体外阳离子聚合物能够通过TLR-4信号通路来重塑MDSCs的表型使其向M1型MDSCs转化,抑制MDSCs对T细胞的免疫抑制作用。接下来,我们利用4T1肿瘤模型来研究阳离子聚合物的抗肿瘤效应。结果发现,阳离子聚合物能够重塑MDSCs的表型,使其高表达IL-12、TNF-α和NOS2,低表达IL-10,TGF-β和Arg1,降低MDSCs在荷瘤小鼠外周血、脾脏、肿瘤和骨髓的含量,恢复T细胞的增殖和功能,显著延缓肿瘤的生长,有效延长阳离子聚合物治疗组荷瘤小鼠的寿命。最后,我们在TLR-4-/-荷瘤小鼠上证明了阳离子聚合物是通过TLR-4信号通路来发挥其抗肿瘤效应的。TLR-4敲除后,阳离子聚合物不再能重塑MDSCs的表型。上述研究结果显示,阳离子聚合物可能通过解除MDSCs的免疫抑制效应来提高机体的抗肿瘤免疫应答,具有临床应用的潜力。除了 MDSCs,肿瘤微环境中还有两种免疫抑制细胞:肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤相关调节性T细胞(Treg)。它们都能抑制机体的抗肿瘤免疫反应,促进肿瘤生长。大量的实验证据表明STAT3在肿瘤微环境的TAM和Treg细胞中都是持续活化的,Jak2-STAT3信号通路能够促使巨噬细胞向M2型极化,促进Treg细胞的产生及功能。因此,设计和筛选能够抑制Jak2-STAT3信号通路来重塑TAM的极化及抑制Treg细胞产生的功能小分子化合物极具应用前景。在这一部分研究中,我们从实验室的小分子化合物库中筛选出能够选择性抑制Jak2激酶的小分子抑制剂,化合物21,验证了其能够通过抑制Jak2-STAT3信号通路来促进巨噬细胞向M1型分化,并能够重塑肿瘤模型中TAM的表型,使其高表达IL-12和NOS2,低表达IL-10和Arg1。同时,它还能够抑制Treg细胞的生成及功能。之后,我们利用三种肿瘤模型(Heps、S180和B16F10)探讨了化合物21的抗肿瘤效应,结果显示21#分子能够重塑TAM的表型、抑制Treg细胞的生成及功能,提高荷瘤小鼠在外周血、脾脏及肿瘤组织内CD4+T细胞和CD8+ T细胞的比例及肿瘤部位IFN-γ的含量,抑制肿瘤组织血管新生,显示良好的抗肿瘤活性,是一种极具潜力的抗肿瘤免疫治疗候选药物分子。