胚胎发育过程是发育生物学的核心问题之一。受精完成后,受精卵细胞根据染色体上遗传信息,以一种严格的程序有条不紊地进行生长发育,形成个体。这一遗传程序决定了细胞何时何地开始分化、以及不同的蛋白产物何时何地开始合成等等一系列复杂的生物学事件。尽管对胚胎发育的研究一直如火如荼地开展着,但由于实验材料和方法的限制,到目前为止,对于调控人类胚胎发育的分子网络还所知甚少。人类胚胎发育的4-9周(即大约受精后20-60天)是早期器官发生的关键时期,因此阐明这一时期的基因表达情况及其调控模式至关重要。针对这一问题,本研究采用了多种功能基因组学技术手段,从cDNA文库构建、转录组表达谱芯片分析入手,首次对人类早胚第4至9周这一关键的器官及组织发生时期的基因表达特征进行了较深入的研究；并在此基础上,对新基因的功能进行分析：(1)cDNA文库是在基因组水平上研究细胞、组织、器官、组织乃至于多细胞有机体的特定时期基因表达的前提和基础。为此,我们采用最新的GatewayBP重组技术构建了人胚发育三个阶段(第4周、第5周和第6周)的全长cDNA文库。其中4周人早胚全长cDNA文库的滴度为4.375×104 cfu/ml,总克隆子数为5.25×105,插入率为88.2%,插入片段长度范围为0.5～5.5 kb；5周人早胚全长cDNA文库的滴度为5.875×105 cfu/ml,总克隆子数为7.05×106,插入率为95%,插入片段长度范围为0.3～4.4 kb；6周人早胚全长cDNA文库的滴度为8.360×105 cfu/ml,总克隆子数为1.00×107,插入率为85%,插入片段长度范围为0.5～4.0 kb。上述结果显示,本文构建的cDNA文库的质量良好,为下一步筛选人类早胚中表达的新基因打下了坚实的基础。接着采用生物素标记混合探针的方法,通过菌落原位杂交对人类4、5、6周早胚全长cDNA文库的十余万个克隆子进行筛选,共得到3581个在人早胚发育阶段低丰度表达的基因。进一步的EST测序、在线比对等分析结果显示其中大约1%,共350个基因尚无任何报道和功能提示,为在人早胚4、5、6周低丰度表达的新基因。这些基因的发现将为进一步深入研究早期人胚发育提供重要线索。(2)不同器官及组织一系列复杂而有序的发生,是人类胚胎发育的核心内容。阐明这一时期中相关基因的时空表达模式,对于我们了解人类胚胎发生的分子机制具有深远的意义。为此,我们选用了人类转录本表达谱芯片对人类胚胎器官及组织发生的重要阶段(第4周至第9周,共6个发育时期)的转录组表达谱分别进行检测。结果显示,每个发育时期有近50%的转录本被检测到,六个发育时期共计28761个转录本(57.4%)有表达,其中显著差异表达的转录本共5358个(18.6%),大部分尚未被GO(基因本体论数据库)定义与发育相关。聚类分析结果显示,这5358个转录本的表达模式和其在胚胎发育中承担的生物学功能息息相关。进一步通过详细分析这些基因的表达模式,发现参与相同生物学过程的基因群,其表达谱往往类似；而表达谱相似的基因群,其生物学功能也往往相近。据此,我们构建了包含整体芯片数据的数据库及相应的检索平台。(3)为了进一步地探索在4、5、6周中低丰度表达的350个新基因的功能,在基因水平上研究人类胚胎的发育过程,我们首先调查了新基因在人基因组转录谱芯片上的表达情况,结果显示,这些基因在7-9周人胚中变化显著,其中大部份不表达或者持续低丰度表达,但也有一小部分基因的表达量有显著增长。这一结果提示我们,这部分表达量有变化的新基因可能参与了7-9周人胚发育的重要事件。为了证实对这些新基因的功能预测,我们随机挑取了Plac9这个在4-6周和7-9周变化显著的新基因——4-6周低丰度表达,7-9周高表达(p<0.05)进行功能初探。通过我室所构建的人类胚胎转录组数据库对plac9进行检索显示,和plac9具有相似表达谱的基因群中富含和胶原蛋白合成、成骨细胞增殖等相关的基因,由此我们推测plac9极有可能参与了早期人胚的骨骼形成过程。接着我们通过实时荧光定量PCR、RT-PCR和免疫荧光等实验技术对plac9的基因的基本分子生物学特征进行了分析。结果显示,该基因可能是通过剪切信号肽分泌到胞外行使功能,从而参与骨骼发育的调控分子网络。综上所述,本研究通过cDNA文库构建、筛选和表达谱芯片分析技术对人类早胚4-9周的基因表达模式进行了较深入的研究。发现了350个在人早胚4、5、6周低丰度表达的新基因,并基于表达谱芯片构建了人早期胚胎转录组数据库平台。此外,以转录组表达谱信息为指导,对一个新的胚胎发育调控因子plac9在骨骼形成中的功能进行了初步分析,实验结果与此前对其功能的预测高度-致。这些结果不仅为理解人类胚胎发育和绘制人早胚基因调控分子网络图提供了重要的分子资源,也为进一步寻找、鉴定和研究发育相关新基因提供参考模式。