肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种早期诊治困难、预后极差的恶性肿瘤。肝癌的发生发展以及转移复发是多因素参与的多步骤、多阶段的病理过程,传统的单基因研究模式限制了肝癌相关分子的准确定位,而近年来迅速发展的蛋白质组学研究已成为目前肝癌研究中的新热点。蛋白质组学能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中全部蛋白质种类和数量的变化,是一种有效的高通量的研究模式,有助于全面地阐明复杂的疾病发病机理、寻找疾病诊断的特异性标志物和药物治疗的靶标。本研究用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱发大鼠HCC,以r-谷氨酰转肽酶(r-glutamyl transpeptidase,γ-GT)染色阳性的肝细胞增生灶为标志获取肝癌前病变的组织标本,运用比较蛋白质组学技术对大鼠正常肝组织、癌前病变组织和肝癌组织的全蛋白质组表达谱进行差异分析,筛选出一批差异表达蛋白质,对其中的部分蛋白如层粘连蛋白受体1(laminin receptor 1,67LR或LAMRl)、膜联蛋白1(annexin 1,ANXA1)、鲱精胺酶(agmatinase)进行表达验证,并用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术和肿瘤相关生物学鉴定方法对67LR进行了功能分析。研究分以下四部分进行。第一部分动物实验—DEN诱发大鼠肝癌本部分应用DEN诱发大鼠肝癌,获取肝癌发生过程中不同阶段的肝组织,为下一步的肝癌蛋白质组学研究提供标本。6周龄的近交系健康雄性Wistar大鼠,随机分为实验组和对照组,实验组动物经DEN腹腔注射诱发肝癌;对照组不给予DEN,按正常方法饲养。实验至30W结束。实验过程中定期处死实验组及对照组动物,收集肝组织标本,并通过HE染色、γ-GT组织化学染色动态观察诱癌过程中不同阶段肝细胞的病理组织学变化及γ-GT灶的形成情况。病理组织学检查结果显示,实验组大鼠肝癌发生的最早时间为实验第21周,该组存活至30W的5只动物均发生HCC;对照组无1例发生肝癌。γ-GT组织化学染色显示实验组在诱癌早期即出现少量γ-GT阳性肝细胞增生灶,灶面积比较小;随着诱癌时间的推移,γ-GT阳性灶增多、增大,γ-GT阳性灶总面积与肝组织切片面积比达29%～43%。肝癌组织的整个切面均显示γ-GT染色阳性。对照组动物肝组织未发现γ-GT阳性灶。通过本部分研究,对大鼠肝癌前病变、肝癌及正常肝组织进行辨别,获得了准确的组织标本用于下一步研究。第二部分大鼠肝癌发生过程中的比较蛋白质组学研究为了筛选在大鼠肝癌发生过程中的差异表达蛋白质,本部分应用双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)等比较蛋白质组学技术,对大鼠正常肝组织、癌前病变组织、肝癌组织的全蛋白质差异表达谱进行分析。选择大鼠正常肝组织、癌前病变组织(γ-GT阳性灶总面积占肝组织切片面积的29%～43%)、肝癌组织各6例,分别提取各个样本的肝组织总蛋白;每组取其各个样本的等量蛋白混合为一个总样本。应用非线性IPG胶条和12%的SDS-PAG进行双向凝胶电泳分离总蛋白质(每一组的混合样本均在相同条件下分别进行3次双向电泳以保证重复性)。用ImageMaster软件对三组的全蛋白质表达谱进行差异分析,筛选出表达水平差异≥2倍的蛋白点127个。挖取这些蛋白点进行胶内酶解后用MALDI-TOF-MS/MS进行质谱分析,数据通过NCBI非冗余数据库和MASCOT搜索引擎检索。结果鉴定出67LR等82种蛋白质。其中,在正常肝组织→癌前病变组织→癌组织表达依次上调的蛋白质有8种,如67LR、转铁蛋白、醛酮还原酶188等;在正常肝组织→癌前病变组织→癌组织表达依次下调的蛋白质有22种,如鲱精胺酶、谷胱甘肽过氧化物酶、a电子传递黄素蛋白、铜-锌超氧化物歧化酶等;在癌组织上调而在正常肝组织与癌前病变组织表达水平相仿的蛋白质有14种,如谷胱甘肽硫转移酶、波形蛋白、膜联蛋白1等;在癌组织下调而在正常肝组织与癌前病变组织表达水平相仿的蛋白质有14种,如脂肪酸结合蛋白1、硫氧还原蛋白过氧化物酶5等。第三部分差异蛋白67LR、ANXA1、Agmatinase的表达验证由于从2-DE到质谱鉴定技术流程长、环节多,影响因素多,为了保证以上筛选结果的可靠性以便对相关分子作进一步研究,本部分研究对筛选出来的部分蛋白质进行差异表达的再验证。应用RT-PCR和Western blot技术,分别检测67LR、ANXA1、Agmatinase的mRNA和蛋白表达水平。结果表明:①67LR在大鼠正常肝组织、癌前病变组织、肝癌组织中的mRNA表达水平和蛋白质表达水平均依次上调。并且,67LR在人的正常肝组织、肝癌旁组织、肝癌组织的蛋白表达水平也依次上调。②ANXA1的mRNA表达水平在大鼠正常肝组织、癌前病变组织、肝癌组织中依次上调;蛋白表达水平在大鼠正常肝组织和肝癌前病变组织相仿、在肝癌组织的表达明显增高。即ANXA1在不同组织的差异表达趋势在mRNA水平和在蛋白质水平不完全一致;③Agmatinase在大鼠正常肝组织、癌前病变组织、肝癌组织的mRNA表达水平和蛋白质表达水平均依次下调。第四部分肝癌差异表达蛋白67LR的功能研究为了进一步探讨67LR在肝癌发生发展中的作用,本部分应用RNAi技术和肿瘤相关生物学功能鉴定方法,研究67LR表达沉默对人肝癌细胞系Hep3B相关功能的影响。将化学合成的67LR小干扰RNA(siRNA)瞬时转染Hep3B细胞后,用Real-Time PCR和Western blot检测证实Hep3B细胞中67LR的mRNA和蛋白表达均受到明显抑制。设置67LR siRNA转染组(RNAi组)、转染无效用dsRNA组(阴性对照组,Mock)和未转染组(空白对照组,Con),观察三组细胞的凋亡、生长、粘附、运动和侵袭等肿瘤相关生物学功能的变化。流式细胞仪分析结果显示,凋亡细胞比例在RNAi组、Mock组、Con组分别为15%、6%、6%。MTF实验结果显示,RNAi组的细胞生长抑制率在24h、48h、72h分别为14.4%、20.0%、24.2%。粘附实验结果显示,RNAi组的粘附细胞数在20min、40min、60min时均少于Mock组和Con组(p＜0.05)。体外运动实验结果显示,穿过微孔滤膜到达下室面的细胞数在RNAi组、Mock组和Con组分别为18±6、30±7和33±7个,RNAi组与其余两组比较有显著差异(p＜0.05)。体外侵袭实验结果显示,穿过Matrigel和微孔滤膜到达下室面的细胞数在RNAi组、Mock组和Con组分别为4±2、12±3、13±3个,RNAi组与其余两组比较有显著差异(p＜0.05)。以上结果表明,67LR表达被干扰后Hep3B细胞凋亡增加,细胞生长、粘附、运动和侵袭能力均明显下降。结论1.应用HE染色和γ-GT组织化学染色相结合的办法能对大鼠肝癌前病变、肝癌及正常肝组织进行辨别,从而准确获得肝癌前病变组织、肝癌组织及正常肝组织用于比较蛋白质组学研究,实现动态观察肝癌形成过程中差异表达蛋白的目标。2。与肝癌相关的差异表达蛋白有多种表现类型,主要有:①在正常肝组织→癌前病变组织→癌组织表达依次上调;②在正常肝组织→癌前病变组织→癌组织表达依次下调;③在癌组织上调而在正常组织与癌前病变组织表达水平相仿;④在癌组织下调而在正常组织与癌前病变组织表达水平相仿。提示肝癌的发生发展过程可能有多种蛋白以多种方式参与。3.67LR与肝癌细胞系Hep3B的凋亡、粘附、运动和侵袭等功能有关,可能参与肝癌的发生发展和侵袭转移过程。它在大鼠正常肝组织→癌前病变组织→肝癌组织以及在人正常肝组织→癌旁组织→肝癌组织依次明显上调的表达模式,提示它有可能成为肝癌早期诊断标志和防治靶标,并为肿瘤的侵袭转移机制和防治提出了新的思路。4.其它本研究筛选出的肝癌相关候选蛋白如ANXA1、Agmatinase等有可能成为有应用价值的肝癌分子标志。