目的:p190B RhoGAP(p190-B)是由ARHGAP5基因编码的蛋白,位于人类14号染色体的长臂12区(14q12),此区已有文献报道在人非小细胞肺癌中是异常扩增的区域。一些研究发现,p190-B作为RhoGAP家族重要成员之一,可以调节Rho家族中small GTPase分子如:RhoA,Rac1以及cdc42的活性状态,从而参与细胞骨架的重塑、细胞粘附、细胞极性的维持、细胞增殖与分裂以及细胞迁移等过程,而这些过程也正是肿瘤发生发展中的必要步骤。此外,p190-B可调控MMPs的活性,促进细胞外基质的降解,并且对血管生成有重要的调节作用。上述研究结果提示,p190-B与细胞的迁移尤其是肿瘤细胞的侵袭和转移有明显的相关性。目前有关p190-B的研究较多见于乳腺癌中,而在肺癌中的报道研究少见。本研究旨在探讨p190-B在人非小细胞肺癌组织中的表达情况,分析其表达与病例临床病理特征之间的关系;以非小细胞肺癌细胞株A549为模型,从细胞增殖、迁移及侵袭方面进一步阐明p190-B表达在人非小细胞肺癌发生及进展中的作用。研究结果可为非小细胞肺癌的病因研究提供一定的理论依据。方法:(1)采用免疫组织化学染色方法,检测54例非小细胞肺癌患者肿瘤组织及其相应正常肺组织石蜡包埋切片中p190-B的表达情况,并分析其表达与临床病理特征的关系(。2)采用Real-time PCR和Western blot方法,检测23例人非小细胞肺癌组织及其匹配的正常肺组织中p190-B在蛋白以及mRNA(ARHGAP5)水平的表达情况。(3)利用siRNA干扰技术沉默p190-B的表达,以脂质体法用ARHGAP5 siRNA转染A549细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测ARHGAP5 siRNA的干扰效率。并进一步采用MTT法、克隆形成实验观察ARHGAP5 siRNA对A549细胞增殖活性的影响。采用Boyden小室实验以及划痕实验,评价ARHGAP5 siRNA对A549细胞迁移和运动能力的影响。结果:一、p190-B在人原发非小细胞肺癌组织中的表达情况1 54例非小细胞肺癌样本中p190-B表达的免疫组织化学检测结果:1.1 p190-B在肺癌组织及对应正常肺组织中的表达正常肺组织中,p190-B在肺泡壁或肺泡腔中的巨噬细胞呈强阳性表达,而在肺泡上皮细胞以及支气管粘膜上皮细胞中主要表达为阴性。在非小细胞肺癌组织中,p190-B阳性表达定位于肿瘤细胞的胞浆内,呈棕黄色颗粒状。54例肺癌组织中p190-B均呈不同程度的阳性表达,其中25.93%的病例表达为“+”,27.78%表达为“++”,46.30%表达为“+++”。p190-B蛋白在非小细胞肺癌肿瘤组织中的高表达率为74.07% (40/54)。上述结果表明,p190-B在肺癌组织中的表达明显高于其相应的正常肺组织(P=0.000)。1.2非小细胞肺癌肿瘤组织中p190-B表达与临床病理参数的关系在非小细胞肺癌组织学分型中,p190-B的高表达率在腺癌和鳞癌组织中分别为89.29% (25/28)和57.69% (15/26)。结果表明p190-B在腺癌中的表达明显高于其在鳞癌中的表达(P<0.05)。此外,p190-B的表达在淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组,用统计学Spearman相关分析发现,随着淋巴结转移程度的增加(N0-N2),p190-B蛋白的表达量越高,表明P190-B蛋白的表达量与淋巴结转移呈正相关(r=0.704, P=0.000)。同时,P190-B蛋白的表达量与TNM分期呈正相关(r=0.713,P=0.000)。而p190-B的蛋白表达与患者年龄、性别均无关(P>0.05)。2 23例非小细胞肺癌样本中p190-B在蛋白以及mRNA水平的表达情况:分别提取23例人原发非小细胞肺癌肿瘤组织和相应正常肺组织总蛋白和总RNA,采用Western bolt方法以及Real-time PCR方法,检测p190-B蛋白以及ARHGAP5 mRNA(编码p190-B蛋白)在肿瘤组织和相应正常肺组织中表达的差异。Western bolt检测结果表明,p190-B蛋白在肺癌组织中的表达明显高于其匹配的正常肺组织。Real-time PCR检测结果表明,65.2%(15/23)的病例其肿瘤组织中ARHGAP5 mRNA的表达显著高于其匹配的正常肺组织。进一步以肿瘤组织和正常肺组织作为两个样本,分别计算ARHGAP5 mRNA在两组中的平均表达量进行比较。结果表明ARHGAP5 mRNA在肿瘤组织中的表达明显高于正常肺组织(P<0.05)。综上研究结果,在人原发非小细胞肺癌组织中,p190-B的表达明显高于相应的正常肺组织中,尤其在腺癌组织中表达更为显著。此外,p190-B表达与患者的淋巴结转移以及临床TNM分期呈正相关。二、利用siRNA干扰技术,探讨p190-B在肺癌中的作用为进一步探讨p190-B在肺癌中的生物效应,我们采用siRNA干扰技术,用ARHGAP5 siRNA转染A549细胞,从细胞增殖、侵袭以及迁移方面观察p190-B在肺癌中的作用。1 siRNA干扰效率的检测:分别将ARHGAP5 siRNA1、siRNA2以及Negative control siRNA(NC siRNA)转染A549细胞,于转染后48小时收集细胞,采用Western Blot和Real-time PCR方法检测p190-B蛋白以及ARHGAP5 mRNA表达的变化。Real-time PCR结果显示:ARHGAP5 siRNA1和siRNA2均可以显著降低A549细胞ARHGAP5 mRNA的表达。与NC siRNA转染对照组相比,ARHGAP5 mRNA的表达在siRNA1和siRNA2转染组细胞中分别降低了75%和64%。Western blot检测结果同样表明,p190-B蛋白的表达在ARHGAP5 siRNA1和siRNA2转染组明显低于对照组细胞。上述结果表明,两个siRNA序列均可以明显干扰p190-B的表达,尤其以siRNA1效率更加显著。因此,后续的实验中选择siRNA1序列进行研究。2 ARHGAP5 siRNA1转染对A549细胞增殖的影响分别将ARHGAP5 siRNA1和NC siRNA转染A549细胞,于细胞转染后24h、48h、72h以及96h,采用MTT方法评价ARHGAP5 siRNA1对A549细胞增殖的影响。MTT结果显示:与对照组相比,ARHGAP5 siRNA1转染组细胞生长明显受到抑制。在转染后24h、48h、72h和96h,siRNA1转染组细胞的生长抑制率分别为10.30%、19.29%、21.94%和21.82%。进一步采用克隆形成实验观察ARHGAP5 siRNA转染对细胞增殖能力的影响。结果表明,ARHGAP5 siRNA转染组细胞克隆形成数目较对照组明显减少。综上结果表明,ARHGAP5 siRNA转染可抑制A549细胞的增殖能力,从而说明ARHGAP5的表达对维持细胞的增殖活性具有重要作用。3 ARHGAP5 siRNA转染对A549细胞迁移和运动能力的影响本研究中我们应用两种方法来评价ARHGAP5 siRNA1对A549细胞迁移能力的影响。第一种为Boyden小室方法,于接种后24小时计数穿过膜的细胞数目并拍照记录。结果表明在ARHGAP5 siRNA1组,穿过膜的细胞数目明显低于对照组(NC siRNA)。统计结果显示ARHGAP5 siRNA1转染组穿膜细胞数与NC siRNA转染对照组有显著差异,具有统计学意义(P<0.05)。第二种方法采用细胞划痕实验,分别在划痕后不同时间进行观察。与对照组相比,ARHGAP5 siRNA1转染组细胞朝向划痕迁移的速度明显低于对照组细胞。划痕后24h时,两组间愈合距离即表现出明显不同。至划痕后48h,对照组细胞划痕处已趋于愈合,但是ARHGAP5 siRNA1转染组细胞仅只愈合了40%。综合上述两种实验结果,表明ARHGAP5 siRNA1可降低A549细胞的迁移能力,其在细胞中的高表达可以促进肺癌肿瘤细胞的迁移和运动能力。结论1人原发非小细胞肺癌组织中,p190-B的表达明显高于相应的正常肺组织中,尤其在腺癌组织中其表达更为显著。2 p190-B蛋白的表达与淋巴结转移及患者临床TNM分期呈正相关,提示P190-B与非小细胞肺癌的侵袭与转移相关。3利用特异性的ARHGAP5 siRNA成功干扰了A549肺癌细胞中p190-B的表达。4 ARHGAP5 siRNA转染可抑制A549细胞的增殖能力,从而说明ARHGAP5的表达对维持细胞的增殖活性具有重要作用。5 ARHGAP5 siRNA1可降低A549细胞的迁移能力,其表达在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用。