蜡梅(Chimonanthus praecox L.),花开于冬季,在我国已有上千年的栽培历史。蜡梅整朵花的颜色基本是由黄色或者淡黄色的中被片颜色决定的,鲜有其它颜色的报道。目前对蜡梅花色素的研究主要集中在不同蜡梅品种花色素物质的鉴定上。虽然蜡梅花色素在不同品种中略有差异,不过主要色素物质为类黄酮类化合物。作为园林植物,蜡梅的花色性状是一种重要观赏性状,挖掘类黄酮生物合成相关基因并对其分子调控机理进行研究,具有十分重要的理论价值和应用前景。本课题以红心蜡梅和素心蜡梅为研究对象,基于相应的转录组与蛋白组数据库信息,筛选类黄酮合成相关基因,并对与花青素合成有重要作用的花青素合成酶基因CpANS1和转录因子CpMYB2的功能与作用机理进行探究。本课题主要包括三个部分,第一部分为红心蜡梅和素心蜡梅类黄酮合成相关基因的筛选;第二部分为CpANS1基因的克隆和功能研究;第三部分为CpMYB2基因的克隆以及相关分析。主要研究结果如下:1.蜡梅花被片中类黄酮合成相关基因的获得通过构建红心蜡梅H29和素心蜡梅H64不同花发育时期的转录组数据库以及H29盛花期的蛋白组数据库,分离得到134条unigene和30条蛋白序列。结合H29和H64花被片中色素的构成,推导出蜡梅花被片的中类黄酮化合物的生物合成途径。通过对以上2个品种中类黄酮合成相关基因的表达分析,ANS基因的表达对花青素生物合成具有重要的作用,同时蜡梅花被片中黄酮醇合成酶FLS和花青素合成酶AVS1的不存在竞争性表达。2.花青素合成酶基因CpANS1的克隆与功能分析利用实时荧光定量PCR实验CpANS1基因的表达量进行分析,CpANS1在素心蜡梅中表达量极低,能够对冷胁迫进行响应。将CpANS1基因构建超量表达载体转化拟南芥tds4-2突变体,转基因突变体恢复种皮颜色,并在茎和果荚上有明显花青素积累。超表达CpANS1显著提高拟南芥花青素和原花青素的合成能力,上述结果表明CpANS1基因在植物体中具有催化底物白花矢车菊素生成花青素的能力。3.转录因子CpMYB2的克隆与功能分析CpMYB2基因为R2R3-MYB型转录因子,属于与MYB基因家族的S6亚族。对CpMYB2基因的表达量进行分析发现其表达模式与CpANS1一致。通过双荧光素酶实验分析,CpMYB2基因能轻微的激活CpANS1的启动子活性。CpMYB2蛋白具有很强的转录活性,并且转录激活域位于C端。利用酵母双杂交实验证明CpMYB2可以与CpbHLH1和CpbHLH2发生互作,并且CpMTB2与CpbHLH2共表达时,能够提高CpANS1的启动子活性。在全国87个蜡梅品种中,检测到CpMYB2基因的6种变异类型(CpMYB2a/b/c/d/e/f),这些变异的产生大部分是由于3碱基重复(GGA)位点数量差异导致的,而CpMYB2f变异型是由于CpMYB2基因编码区C端4碱基AAAG的缺失突变导致的。目前调查的素心蜡梅品种的CpMYB2位点都是等位基因CpMYB2ff。