论文部分内容阅读
目的:脑胶质瘤是中枢神经系统原发肿瘤中恶性程度最高亦是发病率最高的脑部肿瘤,其侵袭性和复发率都明显高于其他颅内肿瘤,患者临床预后极其不佳。并且患者术后及放疗治疗后往往需要进一步联合化疗,化疗药物对杀灭残余胶质瘤细胞起着重要作用。长链非编码RNA核富集转录本1（Nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1）是存在于人类第11号染色体上的一个未经过剪切的非编码RNA。其长度约4kb、。研究表明NEAT1在多种恶性肿瘤中表达上调,是一种致癌基因,亦有研究证明其在胶质瘤中呈高表达并与肿瘤的临床分级相关,然而其在胶质瘤中作用的具体机制还亟待研究。随着对低频低强度超声（low-frequency and intensity ultrasound,LFLIU）研究的深入,其生物特性正逐渐被各界学者所接受并应用于实验性和临床的辅助性治疗,尤其在协同药物传递抗肿瘤以及神经退行性疾病方面;而姜黄素虽然具有一定的抗肿瘤作用,但由于其较差的溶解度以及生物利用率,在临床中的应用十分受限。鉴于LFLIU可以提高生物膜的通透性,为提高姜黄素的有效浓度,我们将LFLIU与姜黄素联合应用于胶质瘤细胞。本课题的研究意义在于通过体内外实验验证NEAT1如何调控胶质瘤细胞的生物学进程,以及LFLIU联合姜黄素通过NEAT1影响胶质瘤细胞生物学行为的潜在作用机制。研究方法:本研究以正常脑神经胶质细胞（NHA）和脑胶质瘤细胞U87-MG和U251细胞系为研究对象。第一部分:首先明确NEAT1靶向结合miR-22-3p和let-7b-5p进而影响胶质瘤细胞的生物学行为,（1）双荧光素酶报告基因实验验证NEAT1与miR-22-3p和let-7b-5p的结合作用和结合活性,并明确其结合位点;（2）分别构建与验证NEAT1表达沉默的U87-MG和U251细胞;构建与验证NEAT1与miR-22-3p或let-7b-5p双表达沉默的U87-MG和U251细胞;构建与验证NEAT1表达沉默与miR-22-3p和let-7b-5p过表达的U87-MG和U251细胞;（3）转染后通过qRT-PCR技术检测NEAT1、miR-22-3p和let-7b-5p的表达情况,通过qRT-PCR和Western Blot实验检测并比较处理后的各组细胞中MTDH的RNA及蛋白水平的表达量;（4）通过EdU、Transwell及流式实验检测并比较处理后的各组细胞增殖、侵袭和迁移能力,以及凋亡水平。再者,明确miR-22-3p和let-7b-5p通过调控MTDH进而影响胶质瘤细胞生物学行为的机制,（1）双荧光素酶报告基因实验验证miR-22-3p和let-7b-5p与MTDH的结合作用和结合活性,并明确其结合位点;（2）分别构建及验证miR-22-3p或let-7b-5p表达上调和下调的U87-MG和U251细胞;MTDH表达上调和下调的U87-MG和U251细胞;构建MTDH表达下调与miR-22-3p或let-7b-5p表达下调及上调双转染的U87-MG和U251细胞;MTDH过表达与miR-22-3p或let-7b-5p表达下调及上调双转染的U87-MG和U251细胞;（3）通过Edu、Transwell及流式实验检测并比较处理后的各组细胞增殖、侵袭和迁移能力,以及凋亡水平;（4）Western Blot法检测并比较处理后的各组细胞中MTDH蛋白水平的表达量。接着明确MTDH通过靶向HDAC1和HDAC1/PTEN/Akt信号通路调控胶质瘤细胞,（1）通过Western Blot实验检测并比较沉默及上调MTDH表达后HDAC1蛋白水平的表达量;（2）通过Western Blot实验检测并比较沉默及上调HDAC1表达后肿瘤生物学行为相关标志蛋白及PTEN/Akt信号通路蛋白的表达变化。最后进行体内验证,通过裸鼠移植瘤实验检测下调NEAT1表达后对移植瘤生长的影响。第二部分:探讨LFLIU联合姜黄素对胶质瘤细胞生物学行为的影响,继而明确作用对胶质瘤细胞中NEAT1、miR-22-3p、let-7b-5p、MTDH、HDAC1以及肿瘤生物学行为相关的标志蛋白表达的影响:选用强度为142.0 m W/cm~2的LFLIU和浓度为15μmol/L的姜黄素作为作用条件,将细胞分为对照组（Control）、LFLIU组（U142.0）、姜黄素组（C15）以及联合作用组（C15U142.0）,qRT-PCR实验检测并比较处理后的各组细胞中NEAT1、miR-22-3p和let-7b-5p的表达情况,采用qRT-PCR和Western Blot实验检测并比较处理后的各组细胞中MTDH、HDAC1及相关标志蛋白的RNA和蛋白水平表达量的变化;通过EdU和Transwell实验检测并比较处理后各组细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化情况。结果:（1）qRT-PCR结果显示,相较于人正常星形胶质细胞,NEAT1在胶质瘤细胞中表达水平升高,而miR-22-3p及let-7b-5p在胶质瘤细胞系中表达减低,qRT-PCR和Western Blot实验结果显示MTDH在胶质瘤细胞中RNA及蛋白表达水平的表达量均增高;（2）通过Edu,Trasnwell及流式实验发现,减低NEAT1的表达量后,细胞的增殖、迁移及侵袭的能力被显著削弱,而细胞凋亡水平得到提高;（3）双荧光素酶实验结果显示,NEAT1能够靶向结合miR-22-3p和let-7b-5p;并且qRT-PCR实验证明沉默NEAT1的表达可以上调miR-22-3p和let-7b-5p的表达量;（4）通过Edu,Trasnwell及流式实验发现,上调miR-22-3p和let-7b-5p的表达后,胶质瘤细胞的增殖能力、迁移及侵袭能力被显著削弱,而凋亡细胞所占比例增加;（5）通过Edu,Trasnwell及流式实验发现,与NEAT1沉默组相比,敲减NEAT1的同时上调miR-22-3p或let-7b-5p的表达可以使胶质瘤细胞的增殖、侵袭及垂直迁移能力被明显削弱,而细胞凋亡水平升高;（6）双荧光素酶实验结果显示,miR-22-3p和let-7b-5p二者均可以靶向结合MTDH,且表达量呈负相关;（7）Edu,Trasnwell及流式实验结果显示,敲减MTDH后,细胞的增殖、侵袭及垂直迁移能力被明显削弱,而细胞凋亡水平升高;（8）通过Edu,Trasnwell及流式实验发现,同时上调miR-22-3p或let-7b-5p与MTDH的表达可以部分消除单独上调miR-22-3p和let-7b-5p表达对U87-MG和U251细胞部分生物学进程的作用;（9）HDAC1的表达量与MTDH呈正相关,并且下调HDAC1可以上调PTEN的表达,下调p-PI3K/PI3K、p-m TOR/m TOR以及p-Akt/Akt的表达;（10）裸鼠移植瘤实验结果表明,敲减NEAT1后,移植瘤的生长速度相较于对照组明显减慢,裸鼠的生存时间也因而得以变长;（11）通过Edu和Trasnwell实验发现,与Control组、U142.0组及C15组相比较,C15U142.0联合组显著降低了U87-MG和U251细胞的增殖能力、迁移及侵袭的能力;（12）通过qRT-PCR结果发现,与Control组、U142.0组及C15组相比较,C15U142.0联合组可以降低NEAT1的表达量,提高miR-22-3p及let-7b-5p的表达量;qRT-PCR及Western Blot实验结果均显示,C15U142.0联合作用后可以降低MTDH、HDAC1、Bcl-2、Cyclin D1及MMP9的表达量,上调Bax的表达量。结论:（1）NEAT1、MTDH和HDAC1在U87-MG和U251细胞相较于NHA中呈高表达,而miR-22-3p和let-7b-5p呈低表达;（2）敲减NEAT1可以使得miR-22-3p和let-7b-5p的表达量均升高,继而削弱U87-MG和U251细胞增殖、侵袭及垂直迁移的能力,提高细胞凋亡水平,除此之外,下调NEAT1的表达还可以使裸鼠移植瘤生长速度减慢;（3）NEAT1可以与miR-22-3p和let-7b-5p直接结合,从而减低miR-22-3p和let-7b-5p对MTDH的负向调控作用;（4）下调NEAT1的同时上调miR-22-3p和let-7b-5p的表达可以使得U87-MG和U251细胞的部分恶性生物学行为被显著抑制;（5）MTDH通过靶向HDAC1和HDAC1/PTEN/Akt信号通路调控胶质瘤细胞;（6）NEAT1-miR-22-3p/let-7b-5p-MTDH-HDAC1/PTEN/Akt信号轴可以调控U87-MG和U251细胞的生物学进程;（7）LFLIU联合姜黄素作用后可以通过沉默NEAT1的表达从而抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。