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基础科学的进步推动应用科学的发展。在一百多年前,科学家伦琴发现X射线,目前无论军事的核武器装备,还是民用的核电站建设、以及临床医学开展的放射治疗,都得到了长足发展。但随之而来的放射性损伤也屡见不鲜,严重者除造血系统损伤外常伴有放射性肠黏膜损伤,目前临床尚无疗效明确的治疗方法。国外已有研究表明角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)可以改善大剂量放化疗后的黏膜炎,并已经过美国FDA批准上市。作为同一生长因子家族的成员,角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)有望发挥类似的黏膜损伤治疗作用。本研究团队前期研制出与受体亲和力更高、促细胞增殖活性更强的KGF-2突变体,并发现该突变体可显著提高中低剂量γ射线照射后小鼠的存活率。在此基础上,为深入解决放射性肠黏膜损伤的难题,我们开展了本研究,以期为战时核辐射损伤救治及肿瘤患者放射性黏膜炎的治疗提供新策略。【目的】研究角质细胞生长因子2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)突变体对放射性肠黏膜损伤的治疗作用,并探讨其分子机制。【内容】分别在动物整体水平、组织学水平及细胞学水平开展研究,通过γ射线照射建模,研究KGF-2突变体发挥放射性肠黏膜损伤治疗作用的最佳剂量、给药时间及可能机理,并探讨KGF-2突变体对细胞自噬和凋亡的影响。【方法及结果】将无特定病原体(specific pathogen free,SPF)C57BL/6J小鼠随机分组,用γ射线放射源60 Co对小鼠进行单次全身照射,总剂量为12Gy。分别研究KGF-2突变体不同的给药剂量、给药时间以及不同数量的骨髓细胞移植对结果的影响。通过分析小鼠照射后30d存活率及平均体重变化,照射后72h小肠组织病理变化、凋亡与自噬情况,血炎性因子变化情况及血细胞分析,阐述KGF-2突变体对放射性肠黏膜损伤的治疗效果。同时,我们利用人永生化角质上皮细胞系为模型来研究KGF-2突变体发挥放射保护作用的分子机制。我们发现,模型组小鼠在照射后10d内全部死亡。在量效研究中,照射后30d,低剂量(6mg/kg)和高剂量(12mg/kg)KGF-2突变体给药加骨髓移植组的生存率都优于模型组;在时效研究中,KGF-2突变体(-2d给药)加骨髓移植组的生存率优于KGF-2突变体(-3d给药)加骨髓移植组。在前述研究的基础上,我们降低骨髓细胞移植数至2.0×106个/只,发现照射后30d,KGF-2突变体(6mg/kg,-2d给药)加骨髓移植组小鼠生存率为100%,显著高于对照组(0)和单纯骨髓移植组(60%)。取照射后第7d平均体重变化分析,模型组为14.26±0.48g;单纯KGF-2突变体给药组为15.11±0.90g;KGF-2突变体给药加骨髓移植组为16.24±0.98g;单纯骨髓移植组为15.39±1.08g。在30d观察期内,KGF-2突变体联合骨髓移植组小鼠体重下降缓慢,回升早,且回升后体重稳定。HE染色及免疫组织化学结果显示,照射后模型组小鼠小肠损害明显,小肠绒毛处细胞自噬及凋亡水平增高;KGF-2突变体给药加骨髓移植组小鼠小肠组织各级结构完整,免疫组化显示小肠黏膜上皮细胞自噬增强,凋亡水平降低。与正常组相比,受照射小鼠的白细胞、红细胞和血红蛋白数都明显降低。与模型组相比,予KGF-2突变体和/或骨髓移植治疗后,KGF-2突变体(-2d给药)加骨髓移植组小鼠的红细胞和血红蛋白的回升有统计学差异。ELISA检测发现,与模型组相比,KGF-2突变体给药加骨髓移植组小鼠照射后血IL-6水平降低。为进一步明确KGF-2突变体发挥放射保护作用的分子机制,我们以Ha Ca T细胞系为实验对象,发现经γ射线照射后,细胞自噬相关蛋白LC3及凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达均增高,且自噬发生的时间早于凋亡。我们还发现KGF-2突变体能够激活NF-κB、PI3K-AKT和MAPK-ERK等细胞内重要的信号通路,推测KGF-2突变体对细胞自噬及凋亡发挥重要的调控作用。随后,我们利用细胞饥饿模型探讨KGF-2突变体对细胞自噬及凋亡的影响。细胞经长时间无血清培养后,再予KGF-2突变体刺激,用Western blot法检测胞内凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的表达。发现经无血清培养基长时间培养的细胞,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表达升高,说明长时间无血清培养可诱导细胞凋亡;予KGF-2突变体刺激后,Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表达降低,说明KGF-2突变体可抑制细胞凋亡。用EBSS饥饿细胞,应用Western blot法检测细胞自噬情况,发现LC3表达量增高;再予KGF-2突变体刺激,LC3蛋白表达下降;自噬抑制剂氯喹(CQ)使细胞LC3表达量增高,予KGF-2突变体刺激,LC3表达减少。将p EGFP-C3-MAP1LC3B质粒转染细胞,通过激光共聚焦显微镜观察细胞内GFP-LC3颗粒大小及形态,发现经EBSS饥饿后细胞内GFP-LC3颗粒增多,予KGF-2突变体刺激后GFP-LC3颗粒减少;CQ使胞内GFP-LC3颗粒增多,予KGF-2突变体刺激后GFP-LC3颗粒减少。说明KGF-2突变体可以抑制饥饿诱导的自噬。【结论】在动物水平我们证实,KGF-2突变体给药联合骨髓移植,可有效治疗小鼠放射性肠黏膜损伤,明显提高受照射小鼠的生存率,维持小鼠平均体重的稳定,降低受照射小鼠的炎症水平;在组织学水平我们发现,KGF-2突变体给药联合骨髓移植可促进小鼠小肠黏膜修复,减少肠黏膜上皮细胞凋亡,促进其自噬;在细胞水平我们发现,照射可使细胞发生自噬和凋亡,且自噬发生的时间早于凋亡,同时发现KGF-2突变体能激活NF-κB、PI3K-AKT和MAPK-ERK信号通路,抑制饥饿诱导的细胞自噬和凋亡,这为进一步明确KGF-2突变体对放射诱导的自噬和凋亡的调控奠定了基础。综上所述,本课题证明,KGF-2突变体给药联合骨髓移植对放射性肠黏膜损伤具有明确的治疗作用。在放射条件下,细胞自噬的发生早于凋亡,而KGF-2突变体可激活NF-κB、PI3K-AKT和MAPK-ERK信号通路,并抑制饥饿诱导的细胞自噬和凋亡。这提示我们,KGF-2突变体有可能通过干预细胞自噬过程而发挥抗凋亡的作用,其具体机制仍有待进一步研究。