虫草素(Cordycepin),也称蛹虫草菌素,化学名3′-脱氧腺苷,是第一个从真菌中分离得到的核苷类抗生素,作为蛹虫草菌的主要活性成分,具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种生物学活性,在药物化学领域的研究一直非常活跃。目前,虫草素可以通过化学法和生物法两种途径获得:化学法原料成本高、合成工艺繁琐、产物收率低、副产物多等劣势限制了其广泛应用;生物法具有原料成本低、工艺条件温和等优点,其中,液体发酵技术具有空间利用率高、发酵过程容易控制、且产物生成目的性强等优势,逐渐发展成虫草素的主要生产方式。然而,基于蛹虫草菌发酵生产虫草素周期长,低生产强度限制了其规模化应用,因此,提高虫草素生产强度并实现虫草素的高效生产,具有重要经济及应用价值。本研究尝试在酿酒酵母及大肠杆菌系统异源表达了蛹虫草菌的虫草素合成的关键基因,以缩短虫草素的生产周期,提高虫草素生产强度,研究结果如下:1)以蛹虫草菌Cordyceps militaris 5111为出发菌株,通过巢式PCR技术克隆获得虫草素合成的两个关键基因cm1、cm2,并在大肠杆菌Escherichia coli中表达cm2,利用组氨酸标签分离纯化其蛋白产物CM2。结果显示:SDS-PAGE凝胶电泳表明获得可溶性表达的蛋白CM2,并成功制备其多克隆抗体;然而本研究未在E.coli中获得蛋白CM1产物。基于生物信息学手段对关键酶蛋白CM1和CM2进行结构功能分析预测,表明蛋白CM1属于氧化还原酶类,蛋白CM2属磷酸核糖合成酶类。2)构建携带有虫草素合成的两个关键基因cm1、cm2的整合型和游离型表达载体,并成功将其导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 4126中,筛选得到2株整合型酵母工程菌及6株游离型酵母菌,HPLC检测显示工程菌液体发酵产物中有虫草素的特征峰出现,进一步HPLC-MS分析证实其为虫草素。其中,酵母工程菌S.cerevisiae 4126-P6的发酵性能最优,发酵60 h虫草素产量达到峰值28.48 mg/L,生产强度为0.47 mg/L/h,较蛹虫草菌C.militaris 5111提高了276%。发酵参数分析表明,虫草素在酵母基因工程菌代谢途径中亦属于次级代谢产物,在葡萄糖消耗尽、生物量完成积累完才大量合成于发酵后期。本研究成果为虫草素合成关键酶的改造及虫草素生物合成途径的完整解析提供了理论依据,也为虫草素工业化生产奠定了基础。