论文部分内容阅读
[目的]构建VEGF基因表达载体,并转染Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠的骨髓间充质干细胞,观察和检测VEGF基因的转染效果及其在MSCs中的表达,同时研究静脉移植转染VEGF基因的MSCs对脑梗塞大鼠的治疗作用。[方法]利用基因重组技术,用EcoR I对含有目的基因VEGFA的质粒进行酶切,获得VEGFA基因片段,将其插入pIRES2-EGFP载体构建pIRES2-EGFP-VEGFA真核表达载体,经酶切、测序鉴定正确,采用脂质体转染技术将pIRES2-EGFP-VEGFA导入MSCs,荧光显微镜下观察及流式细胞术检测其转染率,Western Blot检测VEGF基因的蛋白表达;另采取改良线栓法制作SD大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型(MCAO),随机分为VEGF-MSCs组、MSCs组、PBS组、Model组,24h后前三组大鼠分别经尾静脉注射1ml VEGF-MSCs、MSCs、PBS,Model组不做任何处理。细胞移植7d后TTC染色观察模型大鼠脑梗死面积,免疫组织化学法检测模型大鼠脑梗塞区域Ang-2、CD34的表达,并于细胞移植1d和7d对各组大鼠进行神经功能缺损评分。[结果] (1)经酶切、测序鉴定证实成功构建pIRES2-EGFP-VEGFA真核表达载体,其中插入有656bp的VEGFA cDNA,将其转染MSCs后48h在荧光显微镜下观察,可见带绿色荧光的细胞,经计算得到转染率为(34±3.6) %,进一步采用流式细胞术测定转染率为(37±2.8) %。Western Blot检测证实VEGF基因在转染后的MSCs中呈阳性表达;(2)NSS:细胞移植1天后,各组间均无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05);7天后,VEGF-MSCs组、MSCs组较PBS组、Model组低,差异有统计学意义(P<0.05),其中VEGF-MSCs组较MSCs组更低,且差异有统计学意义(P<0.05),Model组与PBS组相比差异无统计学意义(P>0.05);(3)TTC检测脑梗死体积百分比:VEGF-MSCs组、MSCs组较PBS组、Model组低,差异有统计学意义(P<0.05),其中VEGF-MSCs组较MSCs组更低,且差异有统计学意义(P<0.05),PBS组与Model组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(4)免疫组化染色检测脑梗塞区域Ang-2、CD34表达:VEGF-MSCs组、MSCs组较PBS组、Model组高,差异有统计学意义(P<0.05),其中VEGF-MSCs组较MSCs组更高,且差异有统计学意义(P<0.05),PBS组与Model组相比差异无统计学意义(P>0.05)。[结论] (1)成功构建pIRES2-EGFP-VEGFA真核表达载体,通过脂质体转染技术将VEGFA基因转染到MSCs,进而为下一步研究基因修饰MSCs治疗脑梗塞动物模型奠定实验基础;(2)携带VEGF基因的MSCs可以改善MCAO模型大鼠的神经功能,减小脑梗塞体积,并能促进缺血脑组织的血管生成。