目的：T细胞是机体过继免疫的一个重要组成部分，在机体抵抗外来微生物和肿瘤免疫方面有着重要的作用。然而，T细胞的功能必须严格控制，以免对宿主产生不利的作用，例如自身性免疫性疾病的发生。大量的证据表明TCR信号传导在T细胞的发育、功能、活化、免疫耐受以及体内T细胞稳态方面起到重要的作用。两个鸟嘌呤核苷酸释放因子RasGRP1和Sos活化Ras是TCR信号通路中重要的一个传导事件。活化Ras亚型（Kras）是T细胞发育和活化的一个重要步骤[Sos1和RasGRP1KO]。所以Ras的活性必须严格控制。RasGAPs能内在得通过提高GTP酶活性来实现直接负性调节Ras的活性，其包括 p120GAP和Neurofibromin两个Ras负性调节蛋白。除此之外，RasGRP1可由甘油二酯（DAG）激活，而DAG的活性又受到甘油二酯激酶（DGK）的负性调节。这些机制都是保证Ras活性能够被准确调控。而且，在30％的实体肿瘤中发现伴随有Ras活性的增强，这也说明了严格控制Ras活性的重要性。但是增强的Ras活性怎么影响免疫系统仍然是一个未知数。　　方法：⑴培育Kras小鼠并利用流式细胞术检测Kras小鼠脾脏T细胞情况：通过让CD4Cre小鼠（CD4Cre／＋）与携带但不表达caKras的caKras小鼠（Krasfl／＋）杂交，培育得到Kras小鼠(Krasfl/+CD4Cre/+)。取Kras小鼠和对照小鼠外周脾脏T细胞计数、检测T细胞活化、功能和体外增殖能力的情况。⑵用HE染色、免疫组化及流式细胞术研究Kras小鼠肺病变情况：取Kras小鼠及其对照小鼠肺组织做HE染色、用肺内细胞特异性标志物抗体通过流式细胞术和免疫组化相互验证肺内大量增多的细胞类型。⑶培育CD4Cre-Zsgreen小鼠，验证Cre在T细胞内以及除T细胞外其它细胞的表达情况，验证Cre在CD4Cre小鼠T细胞内表达的特异性：通过让CD4Cre小鼠与Zsgreen小鼠（Zsgreenfl／＋）杂交得到CD4Cre-Zsgreen小鼠（CD4Cre/+Zsgreenfl／＋），再用流式细胞术检测CD4Cre-Zsgreen小鼠胸腺内T细胞发育各个阶段（DN1、DN2、DN3、DN4、DP、CD4SP、CD8SP）T细胞Zsgreen的表达情况以及Cre的表达水平；用流式细胞术检测肺内肺泡上皮细胞(AECs)、肺泡巨噬细胞(AMFs)的Zsgreen的表达情况以及Cre的表达水平。用荧光显微镜在组织上检测Zsgreen在肺内细胞上的表达情况。⑷培育caKras-CD4Cre-Zsgreen小鼠，用流式细胞术和免疫荧光显微镜验证Zsgreen在Kras小鼠肺内AMFs和AECs的表达情况：通过让caKras小鼠与 CD4Cre-Zsgreen小鼠杂交，培育得到 caKras-CD4Cre-Zsgreen小鼠(Krasfl/+CD4Cre/+Zsgreenfl/+,简称为Kras-Zsgreen小鼠)；取Kras-Zsgreen小鼠肺组织，利用免疫荧光显微镜检测肺内CD45+细胞和CD45-细胞Zsgreen表达情况。用流式细胞术检测肺内AMFs和AECs Zsgreen表达百分比。⑸验证肺内细胞CD4和EpCam mRNA表达水平：流式细胞术分选AECs、AMFs以及一些阴性和阳性对照细胞，提取mRNA，然后用相应引物做荧光定量PCR，检测细胞的CD4和EpCam mRNA表达水平。⑹测序验证Kras-Zsgreen小鼠的AMFs和AECs mRNA表达突变的caKras：流式细胞术分选野生型（WT）小鼠AMFs和Kras-Zsgreen小鼠的AMFs和AECs。提取细胞mRNA，然后逆转录为cDNA，用含Kras突变片段的引物扩增cDNA，最后用其中一条Kras引物进行DNA测序。　　结果：①Kras小鼠生存期非常短暂，存活时间小于一个月。Kras小鼠脾脏T细胞数减少、T细胞活化标志物CD69升高、产细胞因子IFNγ和IL17A的T细胞比例升高、效应T细胞比例升高、T细胞体外CFSE标记的增殖实验表明Kras小鼠外周T细胞体外增殖能力增强。②HE染色发现Kras小鼠肺内细胞大量增多、肺泡结构被破坏，支气管上皮细胞增生并伴有肿瘤发生。用流式细胞术和免疫组化确认大量增多的细胞为AECs和AMFs。③流式细胞术结果表明：胸腺T细胞DN1和DN2时期，T细胞基本不表达Zsgreen和Cre，从DN3到DN4时期Zsgreen和Cre逐步升高，DP时期Zsgreen和Cre表达接近100%，CD4SP和CD8SP T细胞Zsgreen表达都为100%。Cre在CD4SP T细胞为100%。Cre在CD8SP T细胞则开始下降，50%左右的CD8SP细胞表达Cre。AMFs和AECs的Zsgreen表达水平皆为100%，但AMFs和AECs并没检测到Cre的表达。荧光显微镜发现表达Pro-SPC的AECs同时也表达Zsgreen。④培育得到的Kras-Zsgreen小鼠肺外观颜色呈现为绿色，流式细胞术结果显示肺内增多的AMFs和AECs皆近100%的表达Zsgreen。免疫荧光显微镜确认在Kras-Zsgreen小鼠肺内无论是CD45+还是CD45-细胞都检测到Zsgreen的表达。⑤RT-PCR结果显示：Kras小鼠肺内增多的CD45-细胞高表达EpCammRNA， AMFs和AECs都无检测到CD4 mRNA的表达。⑥测序结果显示在Kras-Zsgreen小鼠的AMFs和AECs cDNA上都检测到等量表达WT和caKras的碱基序列。　　结论：发现在Kras小鼠体内持续过度活化的Ras会导致外周T淋巴细胞呈现为高度活化状态，分泌细胞因子T细胞比例增多、效应T细胞比例增多、T细胞体外增殖能力增强。接着我们发现Kras小鼠肺内大量AMFs和AECs增多，导致小鼠肺泡结构被破坏，肺呼吸功能受损，从而引起Kras小鼠早期发生死亡。用CD4Cre-Zsgreen小鼠确定了Cre曾表达于CD4Cre小鼠的AMFs和AECs前体细胞，而Cre在T细胞内表达的起始时间和表达情况都与对CD4Cre在T细胞表达的认知是一致的。最后用Kras-Zsgreen小鼠进一步确定了Kras小鼠肺内大量AMFs和AECs增生的原因是因为Cre介导的重组发生在Kras小鼠AMFs和AECs上，从而导致AMFs和AECs表达caKras，最终引起Kras小鼠早期发生死亡。因此在使用CD4Cre小鼠在进行T细胞研究的时，尤其有关肺部研究，需要更加严谨的下结论。由于AMFs和AECs都没有检测到Cre的表达但都高效表达Zsgreen，说明Cre介导的重组曾经发生于它们的前体细胞。因此，我们也可以用CD4cre小鼠模型来研究AMFs和AECs的发生发展过程。