研究背景:食管癌是世界上最常见的恶性消化道肿瘤之一,位居世界恶性肿瘤死亡率的第5位。中国是世界上食管癌高发国家,全世界大约70%的病例发生在中国,其中95%的患者为食管鳞癌(ESCC)。食管癌在中国的发病率和死亡率分别位居各类恶性肿瘤第3位和第4位。尽管在过去的几十年里,在化疗、放疗、以及综合治疗等多种治疗手段上取得很大的进步,但ESCC的总体生存率仍然没有得到明显改善,术后总体5年生存率只有10~20%。因此,当前迫切需要寻找新的特异性强、疗效显著且副作用较小的治疗ESCC的药物。PD-0332991是最近发现的一种可口服的小分子化合物,可特异性,可逆的抑制CDK4和CDK6的激酶活性。研究显示PD-0332991对乳腺癌、卵巢癌、脉络膜黑色素瘤、神经胶质瘤等多种癌症具有很好的抑制作用。而且,2015年美国食品与药品管理局(FDA)加速批准PD-0332991(IBRANCE?,palbociclib)联合来曲唑作为治疗雌激素受体阳性(ER+)和人表皮生长因子受体2阴性(HER-2-)绝经后转移性乳腺癌的一线治疗;或者联合氟维司群用于治疗激素受体阳性(HR+)和人表皮生长因子受体2阴性(HER-2-)的晚期或转移性乳腺癌。然而,目前尚无关于PD-0332991对ESCC的研究报道。实验目的:本文以ESCC细胞系为研究对象,以期探讨选择性CDK4/6抑制剂PD-0332991在体外和体内对ESCC细胞的作用及相关作用机制。实验方法:MTS法检测PD-0332991对7种ESCC细胞(EC109、EC9706、CE-81T、KYSE30、KYSE140、KYSE150和KYSE410)体外生长的影响。软琼脂克隆形成实验检测PD-0332991对ESCC细胞的克隆形成能力的影响;PI染色结合流式细胞术检测细胞周期的分布情况;Western blotting检测PD-0332991对Cyclin D1-CDK4/6-Rb信号通路相关蛋白的影响;Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测PD-0332991对ESCC细胞凋亡的影响;CMXRos/MTGreen双染结合流式细胞术检测PD-0332991对ESCC细胞内线粒体膜电位的影响;Western blotting检测凋亡相关蛋白(PARP、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、Active Caspase-3、Survivin、Bcl-XL、Bid、XIAP、Bcl-2、Mcl-1以及Bax)的变化;胞浆蛋白提取结合Western blotting检测PD-0332991对ESCC细胞中cytochrome c分布的影响;Wound healing及Transwell实验检测PD-0332991对ESCC细胞的迁移和侵袭的影响;Western blotting检测PD-0332991对ESCC细胞中MMP-2和MMP-9的影响。使用慢病毒表达sh RNA敲低ESCC细胞中CDK4/6,检测其对ESCC细胞的克隆形成、迁移和侵袭的影响;使用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测PD-0332991对ESCC细胞衰老的影响;应用功能获得(转染FOXM1过表达质粒)和功能丧失实验(转染FOXM1 si RNA)检测FOXM1在PD-0332991诱导的ESCC细胞衰老中的作用;MTS法结合Calcu Syn软件检测PD-0332991与5-FU或Cisplatin是否具有协同抑制ESCC细胞生长的作用;建立EC109细胞裸鼠皮下移植瘤模型(5×106/200μl PBS),检测PD-0332991对ESCC细胞在体内生长的影响;免疫组化实验检测肿瘤组织中p-Rb,增殖相关蛋白Ki67,凋亡相关蛋白Active Caspase-3的表达;苏木素和伊红双染实验检测肿瘤组织中肿瘤细胞的形态变化;Western blotting检测肿瘤组织中p-Rb、Rb、FOXM1及衰老相关蛋白p16的表达;建立KYSE150细胞肺转移模型(1×106/100μl PBS),检测PD-0332991对ESCC细胞在体内转移的影响。实验结果:使用不同浓度的PD-0332991作用72 h,MTS法检测发现PD-0332991对7种ESCC细胞(EC109、EC9706、CE-81T、KYSE30、KYSE140、KYSE150和KYSE410)均有明显的抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)分别为13.45μM、13.94μM、20.15μM、11.42μM、14.29μM、13.27μM和13.71μM。软琼脂克隆形成实验结果显示,随着药物浓度的增加,PD-0332991明显地抑制ESCC细胞的克隆形成。PI染色结合流式细胞术检测发现PD-0332991使ESCC细胞周期阻滞于G1期。Western blotting检测结果显示,随着PD-0332991浓度的增加,p-Rb、Cyclin D1以及E2F下游靶点Cyclin A和Cyclin E蛋白的表达明显地降低,但CDK4、CDK6及Rb总蛋白的表达没有发生明显改变。Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测发现PD-0332991呈浓度和时间依赖性的方式诱导ESCC细胞发生凋亡;Western blotting检测结果显示,随着药物浓度的增加,或者作用时间的延长,PD-0332991明显地诱导PARP、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、以及促凋亡相关蛋白Bid的活化,相应地,增加PARP切割蛋白、Active Caspase-3、及促凋亡相关蛋白Bax蛋白的表达;降低抗凋亡相关蛋白Survivin、Bcl-XL、XIAP及Bcl-2的表达,但不改变抗凋亡相关蛋白Mcl-1的表达。CMXRos/MTGreen双染结合流式细胞术检测发现,随着PD-0332991作用时间的延长,ESCC细胞的线粒体膜电位逐渐降低;此外,胞浆蛋白提取结合Western blotting检测发现,PD-0332991明显地诱导cytochrome c从线粒体向细胞浆中释放,且具有时间依赖性。Wound healing及Transwell实验结果显示,5μM的PD-0332991能明显地抑制EC109细胞和EC9706细胞的迁移。而且,Transwell侵袭实验数据显示,5μM的PD-0332991能够显著地降低EC109细胞和EC9706细胞的侵袭能力。Western blotting检测显示,随着药物浓度的增加,PD-0332991明显地抑制MMP-2蛋白的表达,但对MMP-9的表达没有明显改变。而且,研究发现,使用慢病毒表达sh RNA敲低CDK4只能微弱地抑制ESCC细胞的克隆形成、迁移、侵袭,以及MMP-2蛋白的表达;然而,使用慢病毒表达sh RNA敲低CDK6能够明显地抑制ESCC细胞的克隆形成、迁移、侵袭,以及MMP-2蛋白的表达;更重要的是,同时敲低CDK4和CDK6能够更加显著地抑制这些功能。采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测发现,2.5μM的PD-0332991明显地诱导ESCC细胞发生衰老。进一步的Western blotting数据显示,PD-0332991能够显著地降低FOXM1转录因子的蛋白表达;且具有剂量依赖性。使用质粒高表达FOXM1能够显著地降低PD-0332991诱导的细胞衰老;相反,应用si RNA敲低FOXM1不但能够诱导EC109和EC9706细胞发生衰老,而且能够促进PD-0332991诱导的细胞衰老。MTS法结合Calcu Syn软件分析发现PD-0332991与治疗ESCC的传统化疗药5-FU及Cisplatin具有协同抑制ESCC细胞生长的作用;使用台盼蓝染色法检测发现,PD-0332991能够显著地促进5-FU及Cisplatin诱导的细胞死亡。进一步的Western blotting数据显示,与单用PD-0332991、5-FU或Cisplatin组相比较,PD-0332991与5-FU或Cisplatin联合应用组中PARP切割蛋白显著地增加。使用EC109细胞裸鼠皮下移植瘤模型检测结果显示,150 mg/kg的PD-0332991能够明显地抑制ESCC细胞在体内的生长;免疫组化实验结果显示,与对照组相比,PD-0332991能够明显地降低肿瘤组织中p-Rb,以及细胞增殖相关蛋白Ki67的表达;同时促进凋亡相关蛋白Active Caspase-3的蛋白表达;进一步采用Western blotting检测发现,与对照组相比较,PD-0332991给药组肿瘤组织中Rb蛋白的磷酸化和FOXM1转录因子的蛋白表达均显著地降低,同时,伴随着细胞衰老相关蛋白p16的表达明显地提高,然而,肿瘤组织中Rb总蛋白的表达没有发生明显地变化。KYSE150细胞的裸鼠肺转移模型实验结果显示,与对照组相比,PD-0332991能够显著地抑制ESCC细胞向肺的转移。实验结论:以上实验结果表明,选择性CDK4/6抑制剂PD-0332991在体内和体外均对ESCC细胞具有很好的抑制作用,能有效地抑制ESCC细胞的生长、迁移、侵袭、及转移,并诱导ESCC细胞发生凋亡和衰老。此外,该化合物还能明显地增强ESCC对传统化疗药物5-FU及Cisplatin的敏感性。总之,PD-0332991可能成为治疗ESCC的潜在药物,值得进一步临床试验。