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依匹乳糖和乳果糖均为具有益生元功效的非消化性二糖,它们是具有良好生理功效的乳糖衍生物。近期,生物转化法制备这两种糖的研究引起了大量学者的关注。纤维二糖差向异构酶能够催化甘露二糖、纤维二糖、乳糖和依匹乳糖等二糖的差向异构化反应。一些耐热菌来源的纤维二糖差向异构酶不仅能催化差向异构化反应,还能催化异构化反应,高效地催化乳糖生成依匹乳糖和乳果糖。这使纤维二糖差向异构酶能以廉价的乳糖生产依匹乳糖和乳果糖,且无需加入其他底物,是一种很有工业应用潜力的产依匹乳糖和乳果糖用酶。本课题研究了来源于两种耐热微生物的纤维二糖差向异构酶,研究内容包括对其基因的克隆、表达以及重组酶的纯化和性质鉴定,并且对依匹乳糖、乳果糖的生物合成进行了初步研究。Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485和Caldicellulosiruptor obsidiansis OB47中的纤维二糖差向异构酶氨基酸序列GenBank登录号分别为AFK87331.1和ADL43428.1,编码这两种蛋白的基因全长分别为1,176 bp和1,170 bp,分别编码392和390个氨基酸,将这两段基因导入到pET-22b（+）载体中并在E.coli BL21（DE3）中进行过量表达。表达的重组蛋白通过镍亲和层析进行分离纯化,对纯化后的酶进行SDS-PAGE电泳分析及高效凝胶色谱法分析和酶学性质鉴定。结果表明:纯化后酶的相对分子质量约为47,000和43,500,与它们的理论相对分子质量接近;它们的最适pH分别为7.0和7.5;来源于Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485的纤维二糖差向异构酶的最适温度为65°C,来源于Caldicellulosiruptor obsidiansis OB47的纤维二糖差向异构酶差向异构化和异构化的最适温度分别为70和75°C;两种耐热纤维二糖差向异构酶在较高温度下都具有较好的热稳定性;测定了两种纤维二糖差向异构酶对底物纤维二糖、甘露二糖、乳糖的动力学常数,两种纤维二糖差向异构酶对乳糖的Km值分别为160.6和276.0 mM;kcat值分别为139.4和218.3 s-1;kcat/Km值分别为0.868和0.791 mM-1 s-1。来源于Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485的纤维二糖差向异构酶能够单一地催化乳糖发生差向异构化反应,生成依匹乳糖,在其最适温度及pH条件下,0.05 mg/mL该酶4 h内能转化26%的乳糖（200 g/L）到依匹乳糖（52 g/L）。来源于Caldicellulosiruptor obsidiansis OB47的纤维二糖差向异构酶能催化乳糖发生异构化和差向异构化反应,生成乳果糖和依匹乳糖。在其最适温度及pH条件下1 mg/mL该酶4 h内能够转化200 g/L乳糖生成22 g/L依匹乳糖和108 g/L的乳果糖。