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目的探究体外诱导兔原代骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为血管内皮细胞(vessel endothelial cells,VECs)和起搏样细胞(pacemaker-like cells)的方法和途径,构建体外三维血管化组织工程窦房结,为心血管疾病的生物起搏提供治疗策略。方法1提取兔骨髓间充质干细胞:提取骨髓,采用全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,并观察其形态学及生长增殖情况。2诱导为起搏样细胞:分离兔心脏窦房结,并采用差速贴壁法联合5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brd U)法分离纯化窦房结细胞,观察并记录生长情况;用反复冻融法制备窦房结细胞裂解液,以此作为诱导剂将骨髓间充质干细胞诱导为起搏样细胞,免疫荧光染色法检测诱导后的起搏样细胞表面标志物超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道HCN2(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation,HCN)的表达和免疫细胞化学染色法检测诱导后的起搏样细胞表面标志物肌钙蛋白T(c Tn T)的表达,以未诱导的骨髓间充质干细胞作为阴性对照组;并绘制骨髓间充质干细胞诱导为起搏样细胞生长曲线图。3诱导为血管内皮细胞:提取兔骨髓,分离纯化骨髓间充质干细胞,用内皮细胞培养液诱导骨髓间充质干细胞为血管内皮细胞,显微镜下观察其形态变化并检测细胞增殖情况;用免疫细胞化学染色法检测诱导后的血管内皮细胞因子CD31、CD34,以未诱导的骨髓间充质干细胞作为阴性对照组;并绘制骨髓间充质干细胞诱导为血管内皮细胞生长曲线图。4体外构建三维血管化组织工程窦房结:用CM-dil和DAPI荧光标记诱导后血管内皮细胞的胞膜、胞浆和起搏样细胞的胞核,按照不同分组(A组为血管内皮细胞:起搏样细胞为1:2;B组为血管内皮细胞:起搏样细胞为1:1;C组为血管内皮细胞:起搏样细胞为2:1)将诱导后的血管内皮细胞和起搏样细胞与支架材料Matrigel基质胶复合培养48 h后,倒置显微镜下观察复合体中“成血管现象”,并做统计学分析;并按照血管内皮细胞与起搏样细胞为1:1的比例在支架材料Matrigel基质胶上复合培养行体外构建,并将复合体行冰冻切片观察三维成像及形态学观察。结果1以全骨髓贴壁法可获得骨髓间充质干细胞。2将骨髓间充质干细胞分别经窦房结细胞裂解液诱导后可获起搏样细胞,经内皮细胞培养液诱导后可获得血管内皮细胞,经免疫荧光染色法和免疫细胞化学染色法检测诱导后细胞表面标志物HCN2、c Tn T、CD31、CD34均为阳性。3采用血管内皮细胞和起搏样细胞按照1:1比例在支架材料Matrigel基质胶上复合培养可体外构建三维血管化组织工程窦房结。结论采用窦房结细胞裂解液和内皮细胞培养液可将骨髓间充质干细胞诱导为起搏样细胞和血管内皮细胞,按照血管内皮细胞和起搏样细胞为1:1比例与支架材料Matrigel基质胶复合培养可体外构建三维血管化组织工程窦房结。图47幅;表4个;参105篇。