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dsNKG2D-IL-21蛋白是由两个NKG2D胞外区和IL-21构成的融合蛋白,是利用NKG2D可靶向识别许多肿瘤细胞表面MICA分子的优势,并结合IL-21能够促进NK细胞和CD8+T细胞功能的特点,从而发挥抗肿瘤效应。结肠癌是结肠粘膜上皮的恶性肿瘤,尽管常规手术治疗或术后化疗能够缓解肿瘤的发生发展,但仍存在复发和转移的难题。鉴于课题组前期已制备小鼠dsNKG2D-IL-15融合蛋白,并证实了其在体外能够有效地增强NK细胞的功能并在体内能够显著抑制结肠癌肿瘤生长,而IL-21与IL-15结构上具有高度同源性,抗肿瘤功能更为显著,为寻找更合适的抗肿瘤因子,本课题制备小鼠来源的dsNKG2D-IL-21融合蛋白,通过体外实验初步观察该蛋白是否增强NK和CD8+T细胞的功能,且基于结肠癌荷瘤小鼠模型,观察其是否具备抑制肿瘤生长的活性。目的：为了研究人dsNKG2D-IL-21融合蛋白的体内抗肿瘤活性,本课题试图利用原核表达系统制备同源的小鼠双可溶性NKG2D (dsNKG2D)与IL-21的融合蛋白(即mdsNKG2D-IL-21融合蛋白),并体外和体内观察其对NK细胞和CD8+T细胞生物学活性的影响及体内抗结肠癌肿瘤效应,从而为进一步分析人dsNKG2D-IL-21融合蛋白体内抗肿瘤活性提供直接的实验依据。方法：(1)制备并鉴定小鼠dsNKG2D-IL-21融合蛋白首先,取课题组前期已构建重组质粒pET28a-dsNKG2D-IL-15,以限制性内切酶切去IL-15片段。以pGEMT为载体,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增出小鼠IL-21基因片段,将IL-21片段插入pET28a-dsNKG2D载体,得到重组的pET28a-dsNKG2D-IL-21原核表达载体。将pET28a-dsNKG2D-IL-21重组质粒转化入BL21菌株,用IPTG诱导表达获得包涵体,洗涤包涵体后,纯化并复性,获得鼠dsNKG2D-IL-21重组融合蛋白(mdsNKG2D-IL21)。基于NKG2D抗体和IL-21抗体,以酶联免疫分析法(ELISA)和Western Blot法分别鉴定mdsNKG2D-IL-21融合蛋白内NKG2D及IL-21的结构域；其次利用流式细胞术(FCM)分析mdsNKG2D-IL-21融合蛋白与表达RAE的YAC细胞株的结合能力,并以不表达RAE-1的Ba/F3细胞株作为阴性对照。(2)小鼠dsNKG2D-IL-21融合蛋白对NK、CD8+T细胞功能的影响及其抗结肠癌活性分析取自行制备的mdsNKG2D-IL-21融合蛋白,体外刺激小鼠脾脏淋巴细胞过夜,标记抗体后进行流式细胞术(FCM)分析,检测NK细胞和CD8+T细胞表面CD69和CD107a的表达,胞内染色检测NK细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B的情况；此外,取该融合蛋白进行体内刺激,给小鼠腹腔注射mdsNKG2D-IL-21融合蛋白,24 h后同以上方法检测NK细胞、CD8+T细胞的频率改变及活化状态。取预先培养到对数期的CT-26细胞,给BALB/c小鼠背部皮肤进行皮下接种荷瘤,在成瘤第7 d,将小鼠随机分2组,分别注射PBS(阴性对照)、mdsNKG2D-IL-21蛋白(实验组),持续三周,期间每天观察小鼠肿瘤生长情况并做好记录,21 d后处死小鼠,流式细胞术(FCM)分析荷瘤小鼠脾脏中NK细胞和CD8+T细胞的频率及活化状态。结果：(1)构建的重组表达载体pET28a-mdsNKG2D-IL-21中NKG2D与IL-21序列均与Genbank中的标准序列一致,经诱导在大肠杆菌(BL21)中可获得有效表达,复性后mdsNKG2D-IL-21融合蛋白与NKG2D及IL-21抗体均可特异性结合,并能与NKG2D配体(RAE-1)阳性的肿瘤细胞结合。(2)在体外或体内,mdsNKG2D-IL-21融合蛋白均可促进NK细胞、CD8+T细胞表达CD69,上调NK细胞表达CD107a、颗粒酶B和穿孔素,促进CD8+T细胞分泌IFN-γ,从而促进NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒活性及增殖。对荷瘤小鼠分析显示,相比于PBS治疗组,mdsNKG2D-IL-21融合蛋白治疗组能够有效抑制结肠癌移植瘤的生长,且荷瘤小鼠脾脏中表达CD69、颗粒酶B及穿孔素的NK细胞、CD8+T细胞及CD4+T细胞的频率显著上调。结论：制备了小鼠dsNKG2D-IL-21重组融合蛋白,该蛋白能够刺激NK细胞和CD8+T细胞的活化,并增强其细胞毒活性；体内使用具有抑制结肠癌移植瘤生长的效应,最终为人dsNKG2D-IL-21融合蛋白在体内抗肿瘤应用提供重要的前期实验依据。