腺苷二磷酸核糖化修饰在水稻先天免疫中的功能鉴定

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自然界存在包括细菌、真菌、卵菌、病毒等在内的多种病原,它们在进化中形成了多种致病机制,可干扰植物的正常生长,对植物造成严重的伤害。为抵御病原菌的侵染,植物在长期的进化中形成了先天免疫系统,主要依赖两个层次的防御反应:病原相关分子模式诱发的免疫反应(PTI)和效应蛋白诱发的免疫反应(ETI)。在这两类防御反应中,蛋白质翻译后修饰都发挥着关键作用。腺苷二磷酸核糖化(ADP-ribosyaltion)修饰是一种由PARP聚合酶催化将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)来源的单个或多个ADP-ribose基团共价连接到目的蛋白上的翻译后修饰,分别称为单腺苷二磷酸核糖化修饰(MARylation)或多聚腺苷二磷酸核糖化修饰(PARylation)。目前已经发现PARylation在双子叶模式植物拟南芥中有重要免疫功能,但是在单子叶植物中的功能尚待研究。本研究旨在探究单子叶植物水稻中PARylation的潜在抗病调控功能,主要回答以下三个问题:(1)在单子叶植物水稻中是否存在PARylation?(2)在水稻先天免疫中PARylation的功能有哪些?(3)在单子叶植物中PARylation是否进化形成新的功能?通过遗传、细胞和生化实验,我们发现:1、水稻基因组编码催化PARylation的OsPARPs及其水解的OsPARG1。与其拟南芥同源蛋白相似,OsPARP1、OsPARP2A、以及OsPARP3都定位于细胞核中,而OsPARG1主要定位在细胞质和细胞核中。OsPARPs和OsPARG1蛋白分别表现PARylation以及水解活性。通过原核表达纯化OsPARP1、OsPARP2A、OsPARP3和OsPARG1蛋白并进行体外PARylation以及水解酶活实验,发现OsPARP1、OsPARP2A具有PARylation活性,而OsPARG1表现降解PAR的活性。我们通过对OsPARG1的酶活中心GGG-X7-QEE的第269位的甘氨酸点突变为亮氨酸,其酶活功能部分丧失,表明OsPARG1具有与At PARG1相似的保守的酶活中心。在原生质体中表达的OsPARP1,OsPARP2A也表现较高的酶活,这表明其在植物体内也具有活性,而且表现出比其拟南芥同源蛋白更高的活性。为了确定PARylation是否在单双子叶植物中具有保守性,我们进行了功能互补实验,发现OsPARG1可互补拟南芥parg1突变体的免疫表型,其生物学功能在单双子叶中可能保守。与预期不同的是,利用拟南芥At PARG1基因内源启动子驱动的OsPARG1不仅回补了parg1突变体的免疫缺陷(相比野生型PAMP诱导的免疫基因在parg1表达上调),而且进一步抑制了免疫基因的表达,这表明水稻OsPARG1可能具有更强的酶活或者稳定性,表现了该生化功能在单双子叶中的差异。2、为了研究PARylation在单子叶植物水稻中的免疫功能,我们在水稻ZH11背景下,利用CRISPR-Cas9技术对OsPARP1,OsPARP2A、OsPARP2B、OsPARP3和OsPARG1进行了基因敲除,通过鉴定获得相应的纯合突变株系。在接种稻瘟菌(Magnaporthe oryzae Guy11)和白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae oryzae P6)之后,osparp1、osparp2b、osparp3和osparp1/2a/3相比ZH11更为感病。osparp2a在接种稻瘟菌Guy11和白叶枯病菌P6后相比ZH11差异不明显。这些结果表明,OsPARPs对水稻抗细菌以及真菌病害有重要功能。
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