前言抗菌肽（antimicrobial peptides）是广泛存在于生物界中的一类生物活性肽,由10-50个氨基酸构成。抗菌肽具有相对分子量低、水溶性好、低抗原性和热稳定性强等特点,多数抗菌肽具有抗细菌或真菌的作用,有些还具有抗原虫、病毒或肿瘤细胞的功能,并对动物体内的正常细胞影响较小。此外,由于抗菌肽是通过干扰原核细胞膜结构导致质膜通透性增大,从而引起抑菌或杀菌作用,病原体不易对其产生抗药性,这使其成为新一代抑菌药物的首选研究对象。新的抗菌肽的鉴定及生物学特性研究可为新型抗生素的研发及设计提供分子模板。两栖类动物是从水生鱼类演化到真正陆地生的爬行类动物之间的过渡类群,它们皮肤裸露、湿润,无疑给外界微生物的侵入提供了便利条件,因此在长期的进化历程中,它们的皮肤中演化形成了一套有效的抵御微生物侵袭的防御系统——抗菌肽。为开拓和适应广阔的栖息地及多样的生态条件,相对于其他生物组织而言,两栖类动物皮肤含有数量和种类更多的抗菌肽,是天然抗菌肽巨大的资源库。蛙科（Ranidae）动物是分布最广泛的两栖动物,几乎遍及各大洲,占据着不同的生态地位,它们皮肤抗菌肽在种类和数量等方面,都是极其惊人的。东北林蛙（Rana dybowskii）为主要分布在我国东北长白山脉的重要经济动物,我们的前期工作研究表明,东北林蛙皮分泌物由多种组分组成,其皮肤分泌物抗菌肽粗提物具有广谱的抗菌活性,但其具体成分、结构特点、生物学特性尚不清楚。为系统认识和了解东北林蛙皮抗菌肽特点,本文根据两栖类抗菌肽的保守氨基酸序列设计简并引物,以东北林蛙皮cDNA文库为模板,采用PCR方法克隆并测定了抗菌肽cDNA基因。同时结合质谱技术对东北林蛙皮分泌物进行了分析,鉴定东北林蛙皮抗菌肽分子。对部分东北林蛙抗菌肽进行人工合成或真核细胞表达,并对其结构、生物学功能等进行分析。方法一、东北林蛙皮抗菌肽鉴定及分子多样性1.东北林蛙皮抗菌肽cDNA克隆及序列分析在GenBank中选取已报道的蛙类抗菌肽mRNA序列,经CLUSTALW多序列对比（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）,根据保守序列设计林蛙抗菌肽基因cDNA的5’端简并引物:5’-ATG TTC ACC （A/T） TG AAG AAA-3’。以3’端多聚A为模板,设计反转录引物:5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CTT TTT TTTTTT TTT TTT T-3’。调取抗菌肽基因,连接pMD19-T载体,克隆测序。测得的序列递交NCBI网站进行同源性分析和氨基酸序列分析。2.东北林蛙皮抗菌肽质谱测序以温和电击方法,刺激东北林蛙背部皮肤,获得皮肤分泌物,冷冻干燥,进行电喷雾电离/质谱/质谱（ESI-MS/MS）分析及序列测定。3.东北林蛙皮抗菌肽基本性质的生物信息学分析利用ExpasyProtParam在线分析软件,计算抗菌肽理论分子量、等电点。并依据Kyte and Doolittle方法计算平均疏水值（grand average hydropathy,GRAVY）。二、东北林蛙皮抗菌肽结构与生物学特性1.抗菌肽人工合成以wang和Rink amidate-MBHA树脂为载体,采用对Fmoc或Boc作为α氨基的保护基,人工固相合成法合成东北林蛙抗菌肽。SephadexTM G-15柱层析纯化合成肽,RP-HPLC和电喷射离子质谱（ESI-MS）检测。2.东北林蛙抗菌肽的结构分析抗菌肽二级结构采用ExPASy系统中提供的神经网络预测方法（HNN）进行预测。预测二级结构为α-螺旋的抗菌肽序列利用Antheprot release 5.0进行螺旋轮（Helical wheel）预测,非α-螺旋抗菌肽利用ProBuider（http://nova.colombo58.unimi.it/probuilder.htm）把序列转换为^*.pdb文件,进行蛋白的1D到3D的转换,使用VMD显示,分析氨基酸分布。以50%三氟乙醇/PBS溶液拟膜,利用圆二色技术测定合成肽在PBS和50%三氟乙醇/PBS溶液中CD光谱,分析二级结构。3.抑菌活性和最小抑菌浓度利用琼脂平板法检测抗菌肽抑菌活性,采用微量稀释法测定最小抑菌浓度。4.溶血活性分析微量溶血试验、血平板法测定抗菌肽溶血活性。5.稳定性分别将抗菌肽用以下方法处理:0.25%胰酶37℃消化1小时;反复冻融3次;煮沸5分钟;煮沸30分钟。处理后的抗菌肽利用菌落计数法检测活性。三、东北林蛙皮新型抗菌肽dybowskin-2CDYa表达、活性及结构1.重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）扩增dybowskin-2CDYa基因根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱密码子、dybowskin-2CDYa成熟肽cDNA序列,设计合成引物Zα1 5’CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCGCTGTTGGTAGACACGGTAGAAGATTCGG3’、Zα25’CTAGTCTA GAAATCATCAGTGCTTTCTGTGCTTTCTCAAACCGAATCTTCTGGAGTGTC 3’、Zα11 5’CCGCTCGAGAAAAGAGAG3’和Zα9K 5’CGGAATTCCTAGTCTAGAAATCATCAGT3’,添加XhoⅠ、XbaⅠ酶切位点。利用SOE PCR获取dybowskin-2CDYa全长基因。2.重组质粒构建电泳回收dybowskin-2CDYa片段,限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切pPICZαA和dybowskin-2CDYa片段,T4 DNA连接酶连接,转化感受态细胞JM109,筛选得到的阳性重组质粒进行测序,并对测序结果进行分析。3.dybowskin-2CDYa在毕赤酵母中表达SacⅠ对重组质粒进行单酶切线性化,转化毕赤酵母GS115,阳性转化子摇瓶诱导表达。发酵上清液的抑菌活性检测、RT-PCR mRNA水平检测,液相色谱和质谱检测目的基因转录和表达。4.蛋白含量测定用BCA法测定发酵液上清的总蛋白浓度,计算重组抗菌肽含量。5.表达产物纯化及活性分析旋转蒸发浓缩上清液,浓缩液经凝胶过滤层析、RP-HPLC纯化,获得重组蛋白。利用琼脂平板法检测抗菌肽抑菌活性。血平板法测定抗菌肽溶血活性。6.dybowskin-CDYa结构分析抗菌肽二级结构采用ExPASy系统中提供的神经网络预测方法HNN进行预测。利用Antheprot release 5.0进行螺旋轮预测。以50%三氟乙醇/PBS溶液拟膜,利用圆二色技术测定dybowskin-CDYa在PBS和50%三氟乙醇/PBS溶液中CD光谱,分析二级结构。结果一、东北林蛙皮抗菌肽序列分析挑选阳性克隆子进行测序,使用expasy.org/tools（http://www.expasy.org/）提供的在线分析软件预测氨基酸序列。获得42个基因共编码14种东北林蛙皮抗菌肽。东北林蛙抗菌肽前体由60-67个氨基酸残基构成,包括信号肽、前导肽和成熟肽三部分。信号肽由起始密码子编码的蛋氨酸残基开始,由一组疏水氨基酸残基构成,切割位点位于Cys-Glu之间,长度为22个氨基酸残基,在信号肽和成熟肽之间存在一段前导肽序列（prodomain）,东北林蛙皮抗菌肽的成熟肽始于前导肽激素原转化酶切割位点Lys-Arg序列之后。生化性质分析显示,东北林蛙抗菌肽等电点从3.80至12.60,阳离子电荷数从0至10。质谱分析结果表明东北林蛙皮抗菌肽分子量分布范围为1300-3000 Da,质谱测序结果与cDNA序列分析结果一致。二、东北林蛙皮抗菌肽成熟肽的相似性分析结果相似性分析结果显示,14种东北林蛙抗菌肽分别归属于temporin家族（temporin-CDYa、temporin-CDYb、temporin-CDYc、temporin-CDYd）,brevinin-1家族（brevinin-1CDYa、brevinin-1CDYb、brevinin-1CDYc、brevinin-1CDYd）,japonicin-1家族（japonicin-1CDYa）,brevinin-2家族（brevinin-2CDYa、brevinin-2CDYb）,而dybowskin-1CDYa,dybowskin-2CDYa和dybowskin-2CDYb三肽的氨基酸组成和序列和已报道的抗菌肽具有很小的相似性,经EBIUniProtKB/SWISS-PROT和APD（http://aps.unmc.edu/AP/main.php）查询,未见相似蛋白及肽,属于2类新型抗菌肽。三、东北林蛙抗菌肽成熟肽的二级结构神经网络预测方法的HNN预测结果显示,除dybowskin-1CDYa的二级结构为随机卷曲结构外,其它东北林蛙抗菌肽具有形成α-螺旋结构的潜能。圆二色谱远紫外区扫描结果显示,brevinin-1CDYa、temporin-CDYa、temporin-CDYe和japonicin-1CDYa在磷酸盐缓冲液中于192 nm的波长附近有一个正吸收峰,在约208 nm和222 nm处有负吸收峰,在50%三氟乙醇192 nm波长附近的正吸收峰有所加强,而人工合成的东北林蛙新型抗菌肽dybowskin-1CDYa在PBS缓冲液和三氟乙醇拟膜环境中,均无二级结构特征性吸收峰。四、东北林蛙抗菌肽活性抑菌活性分析显示东北林蛙抗菌肽具有不同程度的抑菌活性,其中dybowskin-1CDYa具有较强的抑菌活性,对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为6μg/mL和3μg/mL,同时dybowskin-1CDYa具有低溶血活性(HC₅₀＞450μg/mL)。东北林蛙抗菌肽具有较好热稳定性,在煮沸和反复冻融条件下仍保留较好的抗菌活性,但其对胰酶敏感。五、dybowskin-2CDYa表达、活性、及结构利用毕赤酵母可以对dybowskin-2CDYa基因进行表达,表达产物量约为0.83mg/mL。活性分析结果显示,dybowskin-2CDYa对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌均有抑制活性,500μM浓度下,未见溶血活性。结构分析显示,dybowskin-2CDYa在PBS亲水环境中是以α螺旋形式存在,而在疏水环境中,无二级结构特征性吸收峰。结论1.一只东北林蛙个体可以同时编码表达至少14种抗菌肽,与其它蛙类抗菌肽相同,它们的信号肽和前导肽十分保,成熟肽高度变异。除已报道的抗菌肽家族外,还存在结构新、抗菌强及低溶血活性的新型抗菌肽。2.东北林蛙皮抗菌肽由13-33个氨基酸残基组成,多为碱性多肽,等电点大于8,带正电荷。除dybowskin-1CDYa外,东北林蛙抗菌肽以α-螺旋结构为主。3.人工合成东北林蛙皮抗菌肽对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌有不同程度抗菌活性,其中dybowskin-1CDYa抑菌活性较强,最小抑菌浓度分别为6μg/ml和3μg/ml,同时dybowskin-1CDYa具有低溶血活性,半数溶血值大于450μg/ml。4.东北林蛙皮抗菌肽具有较好的稳定性,在煮沸和反复冻融条件下仍保留抗菌活性,但其对胰酶敏感。5.利用巴斯德毕赤酵母GS115表达体系能够正确表达得到东北林蛙皮抗菌肽dybowskin-2CDYa。目的多肽的表达量约为0.83 mg/mL。6.表达得到的dybowskin-2CDYa对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌活性和低溶血活性。dybowskin-2CDYa亲水环境以α-螺旋结构存在,在拟膜环境中无二级结构特征性吸收峰。