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47KD尾部相互作用蛋白(tail-interacting protein 47KD,又称甘露醇-6-磷酸受体结合蛋白1或6-磷酸甘露糖受体靶蛋白,缩写为TIP47、M6PRBP1、PP17或M6PBP),是PAT家族成员之一,其与脂滴(lipid droplets,LD)的形成及代谢有密切的关系。本研究利用反转录RT-PCR和RACE技术,克隆得到西农萨能羊TIP47基因的完整cDNA序列,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测了该基因在西农萨能羊12个组织中的表达水平;通过构建腺病毒RNA干扰载体,在奶山羊乳腺上皮细胞中初步探索TIP47基因的功能;对油酸在奶山羊乳腺上皮细胞中对TIP47基因的表达调控进行了初步研究。获得以下主要研究结果:1.得到了山羊TIP47基因cDNA全长序列,为1906 bp(GenBank收录号为:HQ846827),包括5’UTR 82 bp,CDS 1 314 bp,和3’UTR 510 bp,共编码437个氨基酸。经核苷酸和氨基酸序列分析发现,山羊TIP47与GenBank中牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和猪(Sus scrofa) TIP47基因的相似性较高,其中,核苷酸相似性分别为97%、83%、74%和89%,氨基酸的相似性分别为98%、82%、73%和89%;蛋白质结构分析后,TIP47蛋白质的分子量为47.36 KDa,等电点为5.74;其N端存在典型的保守结构域PAT域。2. RT-qPCR技术对TIP47基因进行奶山羊不同组织表达水平检测发现,乳腺、皮下脂肪、心脏、脾脏、肺脏、肌肉(前胸)、肾脏、瘤胃、小肠、肝脏、垂体及卵巢十二个组织中均有TIP47基因的mRNA,其中乳腺组织中表达水平最高,且明显高于其它组织,脾脏、肺脏次之,肌肉组织表达水平最低。3.成功将针对TIP47基因的三对shRNA构建到pENTR/CMV-GFP/U6穿梭载体上,构建了pDsRed1-C1-TIP47红色荧光蛋白载体并筛选到2条相对有效的shRNA序列,构建针对TIP47基因特异性的shRNA腺病毒干扰载体,在HEK 293细胞中进行包装和扩繁后得到的第四代病毒液的滴度为108 U/mL。在乳腺上皮细胞中测定MOI=200,RT-qPCR检测发现TIP47表达得到有效抑制,并使FASN和HSL的mRNA表达显著上调,ATGL mRNA表达下调。4.油红O染色发现油酸处理奶山羊乳腺上皮细胞可有效促进细胞中脂质的积累,RT-qPCR检测发现油酸对TIP47 mRNA表达的调节随时间表现一定的变化规律,可显著促进HSL mRNA的表达,并抑制了ADRP mRNA的表达。综上所述,本研究从西农萨能羊乳腺组织中克隆得到了TIP47基因完整的cDNA全长序列,与牛、人、小鼠和猪的TIP47基因的核苷酸和氨基酸序列同源性较高,蛋白质结构中存在典型的保守结构域; TIP47基因在奶山羊乳腺组织中的表达水平最高,肌肉组织最低。腺病毒介导的RNA干扰导致TIP47基因的表达量显著降低,FASN和HSL基因表达上调,ATGL基因表达下调。油酸处理乳腺上皮细胞后TIP47 mRNA的表达呈现规律性变化,并影响相关基因的表达。本研究为TIP47基因的功能研究等提供了实验依据。