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背景一氧化氮(Nitric oxide,NO)作为神经系统中一种重要的信使分子,具有多种生理功能。但过量的NO就会造成神经细胞损伤,并被认为是人类神经退行性疾病的重要致病因素之一。最新研究显示,冷休克蛋白RBM3(RNA-binding motif protein3)具有很强的神经保护作用,能够保护多种应激因素造成的神经细胞凋亡。但RBM3能否保护NO诱导的神经细胞凋亡却并不清楚,其分子机制也鲜有研究。目的1.探究RBM3对神经细胞的保护作用;2.阐述RBM3保护神经细胞的分子机制。方法1.检测亚低温(32℃)处理对NO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响将SH-SY5Y细胞置于32℃的环境中培养24 h后转移至正常条件下培养,在细胞培养基中加入硝普纳(Sodium nitroprusside,SNP)作为NO供体来诱导细胞凋亡。使用MTT法、DAPI核染色法以及WB印迹法检测细胞的凋亡水平。2.使用siRNA技术探究亚低温的保护作用是否依赖于RBM3将针对RBM3的特异性siRNA转染SH-SY5Y细胞后再使用32℃处理细胞24 h,转移至正常条件下培养并加入SNP处理。使用MTT法、DAPI核染色法以及WB印迹法检测细胞的凋亡水平。3.通过过表达检测RBM3对NO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响将RBM3的真核表达质粒转染SH-SY5Y细胞后,在细胞培养基中加入SNP诱导细胞凋亡。使用MTT法、DAPI核染色法、流式细胞术以及WB印迹法检测细胞的凋亡水平。4.使用WB免疫印迹技术检测RBM3能够调控的信号通路过表达RBM3后在细胞培养基中加入SNP诱导细胞凋亡。使用各个信号通路中关键激酶的磷酸化抗体来检测各个信号通路的活化水平,确定哪些信号通路会受到RBM3调控。5.使用关键激酶的特异性抑制剂检测并确定步骤4的结果用关键激酶的特异性抑制剂处理正常细胞后再使用SNP诱导细胞凋亡。使用MTT法、DAPI核染色法以及WB印迹法检测细胞的凋亡水平。6.检测miR-143在RBM3保护细胞过程中发挥的作用通过过表达RBM3、亚低温处理或使用p38特异性抑制剂处理后再在细胞培养基中加入SNP诱导细胞凋亡,使用荧光定量PCR检测mi R-143的变化。7.检测miR-143对NO诱导的细胞凋亡的影响使用miR-143 mimic或miR-143 inhibitor转染SH-SY5Y细胞后再使用SNP诱导细胞凋亡,使用MTT法、DAPI核染色法以及WB印迹法检测细胞的凋亡水平。结果1.亚低温处理对NO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用;2.使用RBM3特异性siRNA处理SH-SY5Y细胞后,亚低温对NO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用显著降低;3.在SH-SY5Y细胞中过表达RBM3能够模拟亚低温处理对NO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用;4.在SH-SY5Y细胞中,RBM3能够显著抑制NO诱导的p38 MAPK活化;5.使用特异性p38 MAPK抑制剂处理SH-SY5Y细胞能够模拟RBM3对NO诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用;6.RBM3能够通过调控p38 MAPK来下调亲凋亡的miR-143。结论RBM3通过调节p38 MAPK和miR-143来保护NO诱导产生的SH-SY5Y细胞凋亡。这提示我们RBM3能够在神经退行性疾病过程中发挥重要治疗作用,为退行性疾病的预防与治疗提供一条新的途径,对其他的神经系统疾病的治疗也将会有重要的参考价值。