研究背景慢性肾脏病(CKD)及其并发症已成为危害人类健康的最重要的疾病之一,研究慢性肾脏病的发病机理,延缓肾脏疾病的进展有重要意义。进展性肾脏疾病主要表现为肾脏炎细胞浸润和小管间质纤维化,其中肾小管间质纤维化的程度与肾功能恶化程度密切相关。而肾小管上皮细胞活化是肾小管间质纤维化发生和发展的核心环节。近年来,越来越多的证据表明,肾素血管紧张素系统(RAS)的活化以及其导致的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)生产增多是肾小管上皮细胞活化和小管间质纤维化的重要原因之一。血管紧张素II可以直接或间接引起肾小管上皮细胞的损伤。应用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或者血管紧张素受体阻断剂(ARB),能降低蛋白尿,延缓慢性肾脏病的进展。这些研究表明,肾素血管紧张素系统在慢性肾脏病的发生和发展中发挥了重要的作用。肾小管上皮细胞中存在所有的RAS组分,包括血管紧张素原(AGT),肾素(renin),血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ的受体(AT1, AT2)。以往的研究发现肾组织内的AGT主要分布于肾小管上皮细胞,并且肾小管上皮细胞能分泌AGT,提示肾组织局部的AngⅡ主要来源于肾小管上皮细胞产生的AGT。因此肾小管上皮细胞的RAS活化会导致肾组织局部AngⅡ的生成增多,从而促进肾脏疾病的进展。慢性肾脏病还与氧化修饰蛋白(AOPP)的增加密切相关。AOPP是Witko-Sarsat及其同事于1996年在CRF病人血浆中发现的与尿毒症有关的毒素分子,是中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)催化活性氧生成的次氯酸(HC10)作用于蛋白质而形成的蛋白质氧化交联产物。在体外用HClO作用于人血清白蛋白(HSA)亦可得到与CRF病人血浆中类似的AOPP,其结构中存在双酪氨酸和活性羰基基团。对尿毒症患者血浆和体外用HClO制备的AOPP进行光谱分析,显示酸性条件下在波长340nm处有明显的光吸收峰,与天然蛋白质光吸收峰处于波长280nm的光谱特性不同,提示在次氯酸氧化作用下天然蛋白质已发生了分子结构和生化特性的改变。AOPP水平在轻度CRI病人循环中即已开始升高,且随肾功能恶化进行性升高,与血清肌酐水平呈正相关,维持性透析时达到顶峰。血浆AOPP水平与双酪氨酸、戊糖素、新喋呤等氧化应激标志物呈正相关,与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化剂呈负相关,因此AOPP被认为是反映慢性肾衰竭时氧化应激的标志物。本实验室以前的体内实验表明,血浆AOPP浓度与链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型和非糖尿病残肾大鼠模型中的间质炎细胞浸润和小管间质纤维化有关。不仅如此,在体外AOPP还作为炎症介质刺激单核细胞和多形核白细胞呼吸爆发和细胞因子合成,且反应强度与HSA被HClO氧化修饰的程度成正比。长期经尾静脉给动物注射AOPP能显著增高糖尿病大鼠肾脏和高脂动物模型动脉活性氧的产生,提示AOPP本身也可能诱导或加重氧化应激。本实验室近来的研究表明,AOPP主要经RAGE, NADPH氧化酶依赖的信号通路活化血管内皮细胞；AOPP经PKC, NADPH氧化酶途径诱导系膜细胞功能紊乱。Yasunori Iwao等人的研究证实AOPP经CD36导致肾小管上皮细胞损伤。越来越多的证据表明,AOPP是促进肾脏疾病进展的重要因素,但是具体的机制还不完全清楚。本次实验的主要目的即是研究AOPP是否能活化肾小管上皮细胞的RAS,以及其主要的机制。我们通过体外和体内实验证实AOPP主要是通过肾小管上皮细胞上的CD36和RAGE受体介导的信号通路活化肾素血管紧张素系统,本实验结果为今后进一步干预RAS活化提供了新的靶点。研究方法一、无内毒素AOPP修饰蛋白的制备与鉴定将20mg/mlRSA与40nmol/1次氯酸等体积混合,室温放置30分钟,制备出RSA与次氯酸摩尔比为1:140的AOPP。制备的AOPP在无内毒素PBS中透析24小时,除去游离的次氯酸。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20mg/ml RSA与PBS等体积混合,作为对照。AOPP含量通过测定酸性条件下340nm的光吸收,以氯胺T为标准取得。所有制备的AOPP和未经修饰的RSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.025EU/ml。二、细胞实验1.肾小管上皮细胞的培养大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)购自美国ATCC车。细胞复苏后在37℃、5%CO2条件下,用含10%胎牛血清和F12的DMEM培养基培养细胞,待细胞长至80%-90%时,改用无血清培养基静置细胞24小时后用于实验。本研究使用6-10代细胞进行实验。2. AOPP活化肾小管上皮细胞肾素血管紧张素系统肾小管上皮细胞分别与50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于4、8、16、24小时收集细胞,RT-PCR和western blot检测AGT, ACE, AT1的表达情况；Elisa检测细胞匀浆和细胞上清中的血管紧张素Ⅱ的浓度；荧光分光光度计检测细胞匀浆和细胞上清中的血管紧张素转换酶活性。3. AOPP活化肾小管上皮细胞PKC肾小管上皮细胞分别与100μg/ml AOPP或100μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于5、10、15、30分钟分别收集细胞,Western blot检测PKC亚基(alpha, zeta, delta, epsilon, theta)的活化情况。4. AOPP诱导肾小管上皮细胞活性氧的产生肾小管上皮细胞与50、100、200μg/ml AOPP或200μg/ml未经修饰的RSA共同孵育5、15、30,60min,在阻断实验中,细胞分别与超氧化物歧化酶SOD (200U/ml), NADPH氧化酶抑制剂apocynin (100μM)、DPI (10μM)线粒体酶复合体Ⅰ抑制剂rotenone (2μM)、线粒体酶复合体Ⅱ抑制剂TTFA (10μM)、线粒体电子传递链复合体Ⅲ氧化中心抑制剂myxothiazol (10μM), NO合酶抑制剂L-NAME (100μM),黄嘌呤氧化酶抑制剂oxipurinol (100μM)及环氧化酶抑制剂吲哚美辛indomethacin (10μM)等预孵育1小时后用100μg/ml AOPP刺激30min,采用对活性氧敏感的荧光探针DCFH标记细胞,与细胞共同孵育30分钟,收集细胞。荧光分光光度计检测各组细胞荧光强度。5. AOPP活化肾小管上皮细胞NADPH氧化酶5.1 p47phox的磷酸化。肾小管上皮细胞分别与100μg/ml AOPP或100μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于5、15、30、60min收集细胞,免疫共沉淀和western检测p47phox的磷酸化情况。5.2 p47phox与p22phox,Nox4与p22phox,Nox2与p22phox的结合。肾小管上皮细胞分别与100μg/ml AOPP或100μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于5、15、30、60min收集细胞,免疫共沉淀和western检测p22phox与47phox,Nox4, Nox2的结合情况。5.3 NADPH氧化酶亚基p22phox,p47phox,Nox4和Nox2的蛋白的表达。肾小管上皮细胞分别与100μg/ml AOPP或100μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于8,16,24小时收集细胞,western blot检测p22phox,p47phox,Nox4和Nox2的蛋白表达情况。6. AOPP活化肾小管上皮细胞的AP-1肾小管上皮细胞分别与100μg/ml AOPP或100μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于5,15,30,60分钟收集细胞,western blot检测AP-1蛋白的亚基c-jun的磷酸化和c-jun和c-fos的表达情况。7. AOPP活化肾小管上皮细胞NF-kB肾小管上皮细胞分别与100μg/ml AOPP或100μg/ml未经修饰的RSA共同孵育,于5,15,30,60分钊收集细胞,western blot检测NF-kB的p65的磷酸化情况。8. AOPP经CD36, RAGE活化肾小管上皮细胞肾素血管紧张素系统8.1 Western blot检测肾小管上皮细胞megalin, CD36, SR-BI, Lox-1, galection-3, RAGE, SR-A的表达情况。8.2探讨参与AOPP诱导RAS活化的受体8.2.1 RNA干扰技术在基因水平阻断受体的表达。使用Ambion公司大鼠negalin,CD36, RAGE, SR-BI, Lox-1, galection-3, and SR-A siRNA以及转染试剂盒转染肾小管上皮细胞,在基因水平阻断受体的表达。8.2.2研究参与AOPP诱导RAS活化的受体。肾小管上皮细胞生长于6孔细胞培养板上,使用使用Ambion公司megalin, CD36, RAGE, SR-BI, Lox-1, galection-3, and SR-A siRNA以及转染试剂盒按前述步骤分别转染细胞,或CD36, RAGE中和抗体37℃预孵1小时,再给予100μg/ml AOPP刺激24小时,western blot检测RAS组分AGT, AT1的表达情况。9.CD36和RAGE在AOPP诱导的PKC alpha活化中的作用肾小管上皮细胞或者CD36 siRNA转染的肾小管上皮细胞与RAGE中和抗体40ug/ml,37℃预孵1小时,再加入100μg/mlAOPP,于30min收集细胞,Western blot检测PKC alpha的活化情况。10.CD36和RAGE在AOPP诱导的NADPH氧化酶活化中的作用肾小管上皮细胞或者CD36 siRNA转染的肾小管上皮细胞与RAGE中和抗体40ug/ml,37℃预孵1小时,再加入100μg/ml AOPP,于30min收集细胞,Western blot检测NADPH氧化酶的活化情况。11.CD36和RAGE在AOPP诱导的ROS生成中的作用肾小管上皮细胞或者CD36 siRNA转染的细胞分别与RAGE中和抗体40ug/ml,总PKC抑制剂Go6983(1μM), PKCalpha抑制剂Go6976 (1μM),37℃预孵1小时,再加入100μg/ml AOPP,于30min收集细胞,荧光分光光度计检测各组细胞ROS的产生情况。12. PKC与, NADPH, ROS的关系(1)PKC在AOPP诱导的NADPH氧化酶活化中的作用。肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983 (1μM), PKC alpha抑制剂Go6976 (1μM),37℃预孵1小时,再加入100μg/ml AOPP,于30min收集细胞,观察NADPH氧化酶的活化情况。(2)PKC在AOPP诱导的ROS产生中的作用。肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983 (1μM), PKC alpha抑制剂Go6976 (1μM),37℃预孵1小时,再加入100μg/mlAOPP,于30min收集细胞,观察ROS的产生情况。(3)NADPH氧化酶和活性氧对PKC活化的影响。肾小管上皮细胞与总活性氧的抑制剂超氧化物岐化酶c-SOD (200U/ml), NADPH氧化酶抑制剂apocynin (100μM),DPI(10μM) 37℃预孵1小时后,再给予与AOPP(100ug/ml)刺激30min,观察PKC alpha的活化情况。13. PKC, NADPH氧化酶和ROS在AOPP诱导的AP-1和NF-kB活化中的作用肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983 (1μM), PKC alpha抑制剂Go6976(1μM),总活性氧的抑制剂c-SOD (200U/ml), NADPH oxidase抑制剂apocynin (100μM), DPI (10μM),37℃预孵1小时,再加入100μg/mlAOPP,于60min收集细胞,Western blot检测AP-1,NF-kB的活化情况。14. PKC alpha,NADPH氧化酶和活性氧在AOPP诱导肾素血管紧张素系统的活化中的作用肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983 (1μM), PKCalpha抑制剂Go6976 (1μM),总活性氧的抑制剂c-SOD (200U/ml), NADPH oxidase抑制剂apocynin (100μM),DPI (10μM),37℃预孵1小时,再加入100μg/mlAOPP,于24h收集细胞,western blot检测RAS组分AGT, AT1的表达情况。15. NF-kB,AP-1在AOPP诱导的肾素血管紧张素系统的活化中的作用肾小管上皮细胞与NF-kB抑制剂SN50 (100μg/ml), SN50M (100μg/ml), AP-1抑制剂TanshinoneⅡA (30μM) 37℃预孵1小时,再加入100μg/ml AOPP,于24h收集细胞,western blot检测RAS组分AGT, AT1的表达情况。三、动物实验1.动物模型的制备和分组雌性Wistar大鼠(购白南方医科大学实验动物中心)体重120-150g,在SPF级环境(南方医院实验动物中心)饲养,自由进食及饮水,行单侧肾切手术或假手术一周后的动物进行实验。实验动物分组30只大鼠分别行单侧肾切或假手术一周后,单侧肾切大鼠按体重随机分为四组,每组6只大鼠,具体分组如下：1)假手术组：2)单侧肾切除组：3)单侧肾切除+RSA组：native RSA 50mg/kg/d,尾静脉注射4)单侧肾切除+AOPP-RSA组：AOPP-RSA 50mg/kg/d,尾静脉注射5)单侧肾切除+AOPP-RSA组+apocynin组：AOPP-RSA 50mg/kg/d,尾静脉注射+apocynin 100mg/kg/d,灌胃2.标本留取和基本指标检测：于分组后第3周末留取24小时尿液,血浆及肾组织标本,-70℃冻存。留取标本前24小时测大鼠体重,用鼠尾血压计测量大鼠血压。留取血,尿标本后用全自动生化分析仪血白蛋白(ALB)。Elisa法测定尿微量白蛋白3.分光光度法测定血浆,肾皮质匀浆AOPP浓度4. RT-PCR检测肾皮质匀浆肾素血管紧张素系统主要成分AGT, ACE, AT1 mRNA水平的表达情况5. western blot检测肾皮质匀浆肾素血管紧张素系统主要成分ACE, AT1蛋白质水平的表达情况；ELISA法测定24小时尿液中血管紧张素原的含量和血浆和肾皮质匀浆中血管紧张素Ⅱ的含量；荧光分光光度计法检测血清和肾皮质匀浆血管紧张素转换酶活性6.免疫组织化学染色检测肾组织AOPP, AGT, ACE, AT1, angⅡ的表达情况7. western blot检测肾皮质匀浆PKC alpha活化情况。8.荧光分光光度计检测肾皮质匀浆超氧阴离子的产生情况。9. Western blot检测肾皮质匀浆膜蛋白NADPH氧化酶亚基p47phox,p22phox,Nox4和Nox2的表达情况。10. Western blot检测肾皮质匀浆AP-1亚基c-jun的磷酸化以及,c-jun, c-fos的表达情况。11. Western blot检测肾皮质匀浆NF-kB p65磷酸化的情况。四、统计学方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以mean±SEM表示,各组之间连续性变量的比较采用one-way ANOVA,当P<0.05时,用LSD法进行两两比较。不同时间点之间的同一变量比较采用独立样本t检验。所有统计由统计软件SPSS13.0完成。P<0.05为差异有统计学意义。结果一.细胞实验1. AOPP活化肾小管上皮细胞肾素血管紧张素系统(RAS)AOPP以时间和剂量依赖的方式上调肾小管上皮细胞RAS主要组分(AGT,ACE, AT1,AngⅡ)的表达。肾小管上皮细胞分别与50、100、200ug/ml AOPP或RSA(200ug/ml)共同孵育24小时,随着AOPP刺激浓度的增高,肾小管上皮细胞的AGT,ACE, T1 mRNA(P<0.001)和蛋白表达(P<0.001),细胞匀浆和细胞上清的ACE活性(P＜0.001),AngⅡ浓度(P<0.001)逐渐增加,于AOPP(100ug/ml)时达高峰。同时,AOPP以时间依赖的方式上调肾小管上皮细胞RAS主要组分(AGT,ACE, AT1, AngⅡ)的表达,AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)与肾小管上皮细胞共同孵育4、8、16和24小时后,AGT, ACE,AT1 mRNA(P<0.001)和蛋白表达(P<0.001),细胞匀浆和细胞上清的ACE活性(P<0.001), AngⅡ浓度(P<0.001)随刺激时间的延长而逐渐升高,于24小时达高峰。未被修饰的RSA对肾小管上皮细胞的AGT, ACE,AT1mRNA,蛋白表达,AngⅡ的浓度和ACE的活性无明显影响(P>0.05)。2. AOPP活化肾小管上皮细胞PKC大鼠肾小管上皮细胞表达PKC alpha, zeta, delta, epsilon和theta,为了探讨AOPP对PKC活化的作用,我们用western blot的方法检测肾小管上皮细胞PKC亚基磷酸化的情况。结果显示,AOPP刺激5-30min后,膜蛋白中磷酸化的PKCalpha (ratio to total)显著的增加(P<0.001)；而PKC beta, zeta, delta, epsilon and theta的磷酸化蛋白(ratio to total)均无显著变化(P>0.05)。3. AOPP诱导肾小管上皮细胞NADPH氧化酶依赖的超氧阴离子生成肾小管上皮细胞分别与50、100、200ug/mlAOPP孵育30分钟,随着AOPP刺激浓度的增高,ROS的生成逐渐增加,100ug/mlAOPP时ROS的产生量达高峰(P<0.001)。同时AOPP以时间依赖的方式增加肾小管上皮细胞活性氧的产生。肾小管上皮细胞与AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)孵育5min.15min. 30min.60min后,利用荧光分光光度计检测ROS的生成情况,发现AOPP刺激细胞后ROS的值迅速升高,且随着刺激时间的延长ROS的产生量增多,30min时达高峰(P<0.001)。在阻断实验中,我们发现AOPP诱导肾小管上皮细胞产生的活性氧能被SOD清除,同时能被NADPH氧化酶的阻断剂DPI和apocynin显著抑制,抑制率达80%,不能被其它酶的阻断剂所抑制(P<0.001)。4. AOPP诱导NADPH氧化酶的活化和表达上调(1)p47phox的磷酸化肾小管上皮细胞与AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)孵育5-60min,随着刺激时间的延长,p47phox磷酸化增强,30min达高峰,60min内p47phox总蛋白表达没有显著改变(P<0.001)。而100ug/mlRSA对p47phox的磷酸化无影响(P>0.05)。(2)p47phox,NOX4,Nox2与p22phox的结合肾小管上皮细胞与AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)孵育5-60min,随着刺激时间的延长,与p22phox结合的p47phox,Nox4和Nox2增多,30min达高峰(P<0.001),60min内p22phox总蛋白表达没有改变。而100ug/ml RSA对p22phox-p47phox,p22phox-Nox4,p22phox-Nox2的结合没有影响(P＞0.05)。(3)AOPP对p47phox、p22phox、Nox4和Nox2蛋白表达的作用肾小管上皮细胞与AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)孵育8-24h,western blot检测p47 phox、p22phox、Nox4和Nox2蛋白的表达。结果显示随着AOPP刺激时间的延长,p47phox、p22phox、Nox4和Nox2的蛋白表达均显著上调(P<0.001)。而100ug/ml RSA对它们的表达没有显著影响(P>0.05)。5. AOPP活化肾小管上皮细胞AP-1肾小管上皮细胞与AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)孵育5-60min,western blot检测AP-1的亚基c-fos,c-jun的表达以及c-jun的磷酸化情况。结果显示随着AOPP刺激时间的延长,AP-1的亚基c-jun的磷酸化,以及c-fos,c-jun的表达均显著增多(P<0.001)。而100ug/ml RSA对它们的表达没有显著影响(P＞0.05)。6. AOPP活化肾小管上细胞NF-kB肾小管上皮细胞与AOPP(100ug/ml)或RSA(100ug/ml)孵育5-60min,western blot检测NF-kB的亚基p65的磷酸化情况。结果显示随着AOPP刺激时间的延长,NF-kB的亚基p65的磷酸化增多(P<0.001)。而100ug/ml RSA对它的磷酸化无显著影响(P>0.05)。7. AOPP诱导肾小管上皮细胞RAS的活化(1)肾小管上皮细胞可能参与AOPP活化RAS相关受体的表达情况肾小管上皮细胞表面表达negalin, CD36, SR-BI, LOX-1, galectin-3, SR-A,以及RAGE。(2)受体特异性RNA干扰对该受体表达的抑制作用肾小管上皮细胞分别转染negalin, CD36, RAGE, SR-BI, LOX-1, galectin-3或SR-A siRNA后,用western blot检测各受体的表达情况,可以观察到RNA干扰能有效的抑制megalin, CD36, RAGE, SR-BI, LOX-1, galectin-3或SR-A在肾小管上皮细胞中的表达。(3) AOPP经CD36和RAGE受体途径诱导RAS活化肾小管上皮细胞分别转染megalin, CD36, RAGE, SR-BI, LOX-1, galectin-3, SR-A siRNA,或与CD36或RAGE中和抗体37℃预孵1小时,再与AOPP共孵育24小时,western blot检测RAS主要组分(AGT, AT1)的表达情况。结果显示,阻断CD36在肾小管上皮细胞上的作用能显著但不完全抑制AOPP诱导的AGT和AT1的表达上调(P<0.001)。同时,阻断RAGE在肾小管上皮细胞上的作用也能部分抑制AOPP诱导的AGT和AT1的表达上调(P<0.001)。共同阻断CD36和RAGE受体几乎能完全抑制AOPP诱导的RAS组分上调(P<0.001)。而干扰megalin, SR-BI, LOX-1, galectin-3或SR-A在肾小管上皮细胞上的表达对AOPP诱导的AGT和AT1的表达无显著影响(P>0.05)。8. AOPP经CD36和RAGE活化PKC alpha肾小管上皮细胞转染CD36 siRNA或(和)RAGE中和抗体37℃预孵1小时后,再与AOPP(100ug/ml)作用30min,观察PKC alpha的活化情况。结果显示,干扰CD36在细胞的表达或RAGE中和抗体均能显著并且部分抑制PKCalpha的活化,而共同阻断CD36和RAGE受体几乎能完全抑制AOPP诱导的PKCalpha的活化(P<0.001)。9. AOPP经CD36和RAGE活化NADPH氧化酶为了进一步研究受体CD36和RAGE在AOPP诱导的NADPH氧化酶活化中的作用。肾小管上皮细胞转染CD36 siRNA或(和)RAGE中和抗体37℃预孵1小时后,再与AOPP(100ug/ml)作用30min,观察NADPH氧化酶的活化情况。结果显示,干扰CD36在细胞的表达或RAGE中和抗体均能显著并且部分抑制NADPH氧化酶的活化,而共同阻断CD36和RAGE受体几乎能完全抑制AOPP诱导的NADPH的活化(P<0.001)。10. AOPP经CD36和RAGE诱导ROS的产生为了探讨受体CD36和RAGE在ROS产生中的作用,肾小管上皮细胞转染CD36 siRNA,或(与)RAGE中和抗体37℃预孵1小时,再与AOPP(100ug/ml)作用30min,观察ROS产生的情况。结果显示,干扰CD36在细胞的表达,或RAGE中和抗体均能显著抑制AOPP诱导的ROS的产生,而共同阻断CD36和RAGE受体几乎能完全抑制AOPP诱导的ROS的产生(P<0.001)。11.PKC和NADPH氧化酶,ROS的关系(1) AOPP经PKC诱导NADPH氧化酶的活化。肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983, PKC alpha抑制剂G66976,37℃预孵1小时后,再与AOPP(100ug/ml)作用30min,观察NADPH氧化酶活化的情况。结果显示,PKC抑制剂Go66983, Go6976能显著抑制AOPP诱导的NADPH氧化酶的活化(P<0.001)。(2)AOPP经PKC诱导ROS的产生。肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983,PKC alpha抑制剂Go6976,37℃预孵1小时后,再与AOPP(100ug/ml)作用30min,观察ROS的生成情况。结果显示,PKC抑制剂Go6983, Go6976能显著抑制AOPP诱导的ROS的产生(P<0.001)。(3)阻断NADPH氧化酶和ROS的产生能部分抑制AOPP诱导的PKC alpha的活化。肾小管上皮细胞与总活性氧的抑制剂超氧化物岐化酶c-SOD, NADPH氧化酶抑制剂apocynin, DPI 37℃预孵1小时后,再给予与AOPP(100ug/ml)刺激30min,观察PKC alpha的活化情况。结果显示,超氧化物岐化酶c-SOD, NADPH氧化酶抑制剂apocynin, DPI均能部分显著抑制AOPP诱导的PKC alpha的活化(P<0.001)。12. AOPP经PKC alpha和ROS活化AP-1和NF-kB。为了探讨PKC alpha和ROS在AOPP诱导的AP-1和NF-kB活化中的作用,肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983, PKC alpha抑制剂Go6976,超氧化物岐化酶c-SOD, NADPH氧化酶抑制剂apocynin, DPI 37℃预孵1小时后,再给予与AOPP(100ug/ml);刺激60min,观察AP-1和NF-kB的活化情况。总PKC抑制剂Go6983, PKC alpha抑制剂Go6976超氧化物岐化酶c-SOD, NADPH氧化酶抑制剂apocynin, DPI均能显著抑制AOPP诱导的AP-1和NF-kB的活化(P<0.001)。13. AOPP经PKC alpha和ROS活化RAS肾小管上皮细胞与总PKC抑制剂Go6983, PKC alpha抑制剂Go6976,超氧化物岐化酶c-SOD, NADPH氧化酶抑制剂apocynin, DPI 37℃预孵1小时后,再给予与AOPP(100ug/ml)刺激24小时,观察AGT,AT1表达变化情况。结果显示,总PKC抑制剂Go6983, PKC alpha抑制剂Go6976,超氧化物岐化酶c-SOD, NADPH氧化酶抑制剂apocynin, DPI均能显著抑制AOPP诱导的AGT和AT1的表达上调(P<0.001)。14. AOPP经AP-1和NF-kB活化RAS为了进一步确定AP-1和NF-kB在AOPP诱导RAS活化中的作用,肾小管上皮细胞与NF-kB抑制剂SN50,AP-1抑制剂Tanshinone IIA 37℃预孵1小时后,再给予与AOPP(100ug/ml)刺激24小时,观察AGT,AT1表达变化情况。结果显示,总NF-kB抑制剂SN50,AP-1抑制剂TanshinoneⅡA均能显著抑制AOPP诱导的RAS活化(P<0.001)。二.动物实验1.动物模型制备及其特点所有的实验动物都存活。单侧肾切除的大鼠肾重体重比要显著高于假手术组(P<0.001)。在单侧肾切除的大鼠中,尾静脉注射AOPP的大鼠肾重体重比要显著高于对照组和同等剂量的RSA处理组(P<0.001)；而apocynin能够显著抑制尾静脉注射AOPP的单侧肾切大鼠的肾重体重比的升高(P<0.001)。另外,尾静脉注射AOPP的大鼠尿白蛋白的排泄率要显著高于假手术组(P<0.001),单侧肾切对照组和同等剂量RSA处理组,apocyinin能够显著降低AOPP尾静脉注射组的尿白蛋白排泄率(P<0.001)。各组之间的血压,体重均无显著性差异(P>0.05)。2.血浆,肾组织AOPP的水平和AOPP在肾组织的沉积AOPP处理组血浆,肾组织AOPP的水平和AOPP在肾组织的沉积均显著升高。与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,尾静脉注射AOPP组的血浆AOPPP水平升高了近一倍(P<0.001).而各组之间的血清白蛋白水平无统计学差异(P>0.05)。同样,与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,尾静脉注射AOPP组的肾组织匀浆AOPP水平显著升高(P<0.001)。同时,AOPP免疫组织化学的结果显示,尾静脉注射AOPP组肾脏AOPP着色显著增强,且主要部位为肾小管上皮细胞。Apocynin干预能部分抑制AOPP处理组血浆,肾皮质匀浆AOPP水平的升高(P<0.001)。3. AOPP活化肾组织RASAOPP活化肾组织RAS。PCR的结果显示,与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组的肾皮质匀浆中血管紧张素原(AGT),血管紧张素转化酶(ACE),血管紧张素受体1(AT1) mRNA表达显著上调(P<0.001)。肾皮质匀浆western blot的结果显示,与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组的血管紧张素转化酶(ACE),血管紧张素受体1 (AT1)蛋白表达显著上调(P<0.001)。同时,AOPP处理组的尿血管紧张素原(AGT),肾皮质匀浆血管紧张素Ⅱ的浓度和ACE活性也显著升高(P<0.001)。肾组织免疫组织化学的结果表明,AOPP处理组AGT, ACE, AT1和AngⅡ表达显著增强,并且着色部位以肾小管上皮细胞为主。Apocynin干预能显著抑制AOPP诱导的肾组织RAS表达的上调(P<0.001)。而各组之间血浆血管紧张素原,血管紧张素Ⅱ浓度和血清血管紧张素转化酶活性均未见显著变化(P>0.05)4. AOPP活化肾组织PKC alphaAOPP活化肾组织PKC alpha。与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组肾皮质匀浆膜蛋白中的phospho-PKC alpha(ratio to total)显著升高(P<0.001)。Apocynin干预能抑制AOPP诱导的肾脏PKC alpha的活化(P<0.001)5. AOPP促进大鼠肾组织NADPH氧化酶依赖的超氧阴离子的产生AOPP促进大鼠肾组织超氧阴离子的产生。与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组的肾皮质匀浆液的NADPH依赖的超氧阴离子产生增加.Apocynin干预能显著抑制AOPP诱导的超氧阴离子产生(P<0.001)为了进一步确定NADPH氧化酶在AOPP促进肾组织超氧阴离子产生中的作用,我们研究了AOPP对NADPH氧化酶亚基表达的影响。与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组胞膜蛋白组分中的p47phox显著升高,胞浆蛋白组分中的p47phox未见明显变化,膜蛋白p22phox,Nox4,以及Nox2也可见显著升高。Apocynin干预能显著抑制AOPP诱导的NADPH亚基的上调表达(P<0.001)6. AOPP活化大鼠肾组织AP-1与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组的肾皮质匀浆液的AP-1的亚基c-jun的磷酸化和c-jun, c-fos的表达增多.Apocynin干预能显著抑制AOPP诱导的c-jun的磷酸化和c-jun, c-fos的表达增多(P<0.001)7. AOPP活化大鼠肾组织NF-kB与假手术组,单侧肾切除对照组和同等剂量RSA处理组相比,AOPP处理组的肾皮质匀浆液的NF-kB p-65的磷酸化增多.Apocynin干预能显著抑制AOPP诱导的NF-kB p-65的磷酸化(P<0.001)结论一.细胞实验AOPP通过CD36和RAGE受体,活化PKC-NADPH氧化酶途径,诱导细胞产生ROS,进而活化AP-1和NF-kB,最终导致肾小管上皮细胞的RAS活化。二.动物实验：1. AOPP活化大鼠肾组织,尤其是肾小管上皮细胞的RAS。2. AOPP活化肾组织PKC alpha.3. AOPP促使大鼠肾组织超氧阴离子的产生增多,并且其主要来源为NADPH氧化酶。4. AOPP活化大鼠肾组织AP-1。5. AOPP活化大鼠肾组织NF-kB。总之,我们的实验证实AOPP主要是通过CD36和RAGE受体,活化PKC-NADPH氧化酶途径,诱导细胞产生ROS,进而活化AP-1和NF-kB,最终导致肾小管上皮细胞的RAS活化。本实验结果为今后进一步干预RAS活化提供了新的靶点。