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研究背景及目的骨形态发生蛋白2（Bone morphogeneticprotein2,BMP2）在骨发育、稳态及再生过程起到关键作用。尽管重组人工BMP2蛋白（rhBMP2）已用于临床骨折治疗及脊柱融合,但其可能会引起异位骨化、破骨细胞异常活化造成的骨溶解、骨囊肿等一系列并发症。解析BMP2的作用机制,在此基础上增强内源性BMP2功能十分关键。本课题组前期研究发现只负责GPCR信号转导的G蛋白抑制性α亚单位1/3（Gαi1/3）能够介导多种酪氨酸激酶受体信号转导（VEGFR,TrkB等）。BMP2主要通过功能性受体丝氨酸/苏氨酸激酶（RS/TK）激活多个支架蛋白,活化PI3K-Akt,Smads和Erk-MAPK信号,促进成骨相关细胞的存活、再生及骨形成。但BMP2如何激活下游信号通路,是否存在关键蛋白的介导仍需进一步明确。我们首先明确Gαi1和Gαi3（Gαi1/3）在骨代谢中的作用;在此基础上探索Gαi1/3蛋白在BMP2信号转导中的作用及分子机制;最后明确Gαi1/3蛋白在成骨及骨再生中的调控作用。研究方法第一部分:收集苏州大学附属第二医院骨科手术患者骨组织20例,根据术前骨密度、骨形成生化指标（TPINP）、骨吸收生化指标（β-CTx）检测结果分为骨密度正常组及骨质疏松组（高骨转换）。通过qPCR,Western blot检测骨组织中Gαi1/3 mRNA及蛋白表达水平。繁育野生型（WT）和Gαi1/3敲除（DKO）小鼠,通过骨骼双染对出生后三天小鼠骨架进行染色,分析WT,DKO小鼠骨发育情况。对6W及40W小鼠股骨进行Micro-CT检测,分析WT,DKO小鼠骨量情况;同时对其进行H＆E,Masson染色,观测骨小梁数目。通过三点应力实验检测DKO小鼠股骨负荷能力。最后,分离WT,DKO小鼠骨髓来源的原代单核巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDMs）,RANKL诱导破骨细胞分化,进程TRAP染色,观察Gαi1/3对破骨分化的影响。第二部分:在小鼠胚胎成纤维母细胞（Mouse embryo fibroblasts,MEFs）,小鼠成骨前体细胞系（MC3T3-E1）,原代小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）中,利用CRISPR/Cas9等多种分子生物学手段调节Gαi1/3表达水平。BMP2（20ng/mL）处理上述细胞不同时间,Western blot检测BMP2对PI3K-Akt,Smads和Erk-MAPK信号通路相关蛋白的活化影响;同时检测上述细胞中接头蛋白Gab1的磷酸化情况。敲除MEFs 中接头蛋白 Gab1（Gab1-KO）,BMP2（20ng/mL）处理 WT-Gab1,Gab1-KO 不同时间,Western blot检测细胞内Erk-MAPK,PI3K-Akt和Smads信号通路活化情况。通过ImageJ对Western blot条带进行定量分析。第三部分:利用慢病毒、腺病毒转染建立Gαi1/3敲减/过表达的MC3T3-E1,BMSCs和对相应对照细胞。BMP2（20 ng/mL）处理Gαi1/3敲减的MC3T3-E1细胞不同时间,qPCR检测细胞中Runx2,OPN,Sp7,ALP的表达水平;BMP2（20ng/mL）处理Gαi1/3敲减的MC3T3-E1/BMSCs细胞不同时间,Western blot检测上述细胞中Runx2,Sp7蛋白表达情况。BMP2诱导上述MC3T3-E1,BMSCs成骨分化,21天后茜素红检测钙盐结节形成情况,14天后检测碱性磷酸酶（ALP）染色情况。制备WT,DKO小鼠股骨骨折模型,Micro-CT,H＆E,Masson染色检测骨折处骨再生情况;免疫组化检测新生骨组织中Runx2,Sp7,OPN表达情况。研究结果第一部分:在TPINP,β-CTx表达增多的骨质疏松患者骨组织中,Gαi1,Gαi3的mRNA和蛋白表达水平均升高。相较于WT小鼠,DKO小鼠骨骼发育迟缓、颅骨畸形、锁骨短小;成年及老龄DKO小鼠的骨量和骨质量均低于对应周龄段的WT小鼠。敲低Gαi1/3对BMDMs破骨分化无影响。第二部分:在MEFs,MC3T3-E1,BMSCs中,抑制Gαi1/3表达能够显著削弱BMP2诱导的PI3K-Akt,Smads和Erk-MAPK信号转导;单敲Gαi1或Gαi3部分抑制BMP2诱导的信号活化;在Gαi2敲除的MEFs中BMP2下游信号活化不受影响。在Gαi1和Gαi3双敲除的MEFs外源性导入Gαi1或Gαi3,可以部分恢复BMP2诱导的信号转导;反之,过表达Gαi1/3能够增强BMP2对下游Smads等信号的激活。Gαi1/3的缺失抑制BMP2诱导Gab1磷酸化;敲除Gab1抑制BMP2诱导的下游信号活化。第三部分:在MC3T3-E1/BMSCs中,Gαi1/3的敲减抑制Runx2,Sp7等成骨相关基因和蛋白的表达;敲减Gαi1/3后,BMP2促钙盐结节形成和ALP分泌能力减弱;过表达Gαi1/3则能提高BMP2促MC3T3-E1成骨能力。在体实验发现,DKO小鼠骨折后,骨再生情况弱于WT小鼠,新生骨组织中Runx2,OPN,Sp7表达下降。研究结论:（1）Gαi1/3在高骨转换骨质疏松患者骨组织中高表达,Gαi1/3缺失会影响骨形成及骨质量,Gαi1/3可能参与成骨作用。（2）Gαi1/3作为关键蛋白介导BMP2下游Akt-mTOR,Smads,Erk-MAPK信号转导;Gαi1/3蛋白对Gab1的激活是必不可少,Gαi1/3 可通过 Gab1 激活 Akt-mTOR,Smads,Erk-MAPK 信号。（3）Gαi1/3 调控 BMP2促成骨作用,包括钙盐形成及成骨相关蛋白的表达;Gαi1/3缺失抑制BMP2促骨折愈合作用。