病毒性出血热(Viral hemorrhagic fevers,VHFs)是一组病毒性疾病,主要以出血、突起发热和休克为特征。出血热相关的病毒性疾病起病急,随着全球经济一体化及现代交通运输方式的快速发展,传染病跨境传播的风险不断加大,对相应病毒性传染病的组合检测技术提出了更高的要求。目前,实验室主要是通过病毒分离,检测病毒核酸、抗原以及特异性抗体等方法进行实验室诊断。病毒分离被认为是诊断病毒感染的金标准,但是由于耗费时间长,需要标本量大,无法进行多元的检测。本科室已建立了按照症候群和科属分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法,在分地区组合的检测方法上还有待完善。本实验的主要内容是针对按地区分组的出血热及其相关病毒病分组的核酸检测方法,包括实时荧光定量PCR法和液相芯片法。实时荧光定量PCR技术是一种定量分析的方法,这种方法在PCR反应体系中加入荧光基团,并同时利用荧光积累,实时监测整个PCR进程,最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术的灵敏度高且特异性强,特点是省时、便利和快捷,并可以进行绝对或相对定量分析,是实验室常用的检测方法。液相芯片技术是1995年美国Lutminex公司开发的一种高通量检测平台,它可以定性或定量的在一个反应体系中检测100种不同分析物,其优点是节省时间、节省标本,高通量。目前较多应用于蛋白质和核酸的检测研究,如细胞因子的活动水平检测、肿瘤标记物、激素水平和PCR产物的检测等。为了满足出血热相关病毒性疾病跨境传播检出的需要,本研究拟建立按照地区分组的病毒核酸检测方法。首先将纳入病毒按照高发地区进行分组后,分别设计病毒的引物和探针。针对实时荧光定量PCR方法使用的探针为TaqMan探针,针对液相芯片技术的探针5’端添加12C连接臂后进行氨基修饰。使用体外转录得到的各个病毒RNA参考品对两种方法进行灵敏度的评价。1.利用RNA参考品进行分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各个检测的灵敏度,检出限在101～103拷贝/μl。利用50份未感染人血清和所有纳入病毒的模拟标本进行特异性评价,未见有扩增,表明此方法具有良好的特异性。最后通过重复性实验验证各组检测方法的稳定性,显示组内变异系数小于6.84%,组间变异系数小于8.33%。2.将探针偶联到羧基荧光微球后对RNA参考品分组进行的Tem-PCR扩增产物进行检测,评价检测方法的灵敏度和稳定性。利用50份健康人血清标本和30份未感染纳入疾病的病人血清进行特异度检测。结果显示所建立的基于荧光微球的核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102～106拷贝/μl,特异性为100%,组内变异系数均在18%以下,组间变异系数在25%以下,稳定性尚可。本研究建立了出血热及其相关病毒病的快速组合核酸检测技术,并对其进行了初步评价,对纳入病毒病的出入境检测和临床诊断具有积极意义。