【摘 要】
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抗生素的大量使用,在各种环境介质中诱导产生抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes,ARGs),ARGs的传播使细菌产生耐药性,对公共卫生构成了重大威胁。近年来,纳米材料的广泛应用使其在环境中大量残留,其对ARGs转移的影响备受关注。纳米材料通常具有不同的粒径和携带不同种类电荷,这些性质对ARGs传播的影响目前报道较少。本研究以不同粒径和携带不同种类电荷的银颗粒(A
【基金项目】
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国家自然科学基金(21371139); 武汉工程大学研究生创新基金(CX2020342)“纳米银的尺寸效应对抗生素抗性基因向细菌转化的影响”;
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抗生素的大量使用,在各种环境介质中诱导产生抗生素抗性基因(Antibiotics Resistance Genes,ARGs),ARGs的传播使细菌产生耐药性,对公共卫生构成了重大威胁。近年来,纳米材料的广泛应用使其在环境中大量残留,其对ARGs转移的影响备受关注。纳米材料通常具有不同的粒径和携带不同种类电荷,这些性质对ARGs传播的影响目前报道较少。本研究以不同粒径和携带不同种类电荷的银颗粒(Ag)为例,探究它们对富含抗生素及ARGs的养鸡场土壤中微生物多样性、ARGs丰度影响,以及对ARGs在模式细菌中转化的影响及机制。本研究结果为明确纳米材料粒径和携带电荷种类对ARGs传播的影响及原因、选择能降低ARGs传播的纳米材料从而减少ARGs在环境中的传播提供理论基础。论文具体研究内容如下:(1)不同粒径和表面电荷Ag的合成与表征。以硝酸银(Ag NO3)为原料、聚乙烯吡咯烷酮为分散剂、硼氢化钠(Na BH4)为还原剂,改变分散剂和还原剂的量合成不同粒径的Ag;以Ag NO3为原料,利用阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵和Na BH4合成表面带正电荷的Ag。通过X-射线衍射(XRD)、紫外-可见光谱(UV-vis)对合成的材料进行确认,通过动态光散射(DLS)、Zeta电位测量材料的平均粒径和表面电荷。结果表明合成的材料Ag-1-、Ag-2-、Ag-3-表面均带负电荷,粒径分别为9 nm、72 nm和1885 nm;合成的Ag-2+表面带正电荷,粒径为63 nm;(2)研究不同粒径和表面电荷的Ag对土壤中微生物菌群结构和ARGs丰度的影响。将养鸡场土壤暴露于不同性质的Ag 30天,提取土壤DNA,通过16S r RNA基因高通量测序分析不同粒径和表面电荷的Ag暴露对土壤中微生物菌落结构和组成的影响,利用实时荧光定量PCR方法对四类ARGs(四环素类抗性基因tet A,磺胺类抗性基因dfr1、sul1、sul2,链阳霉素类抗性基因str A,氨基糖苷类抗性基因aad A)和一类整合子(int I1)基因的相对丰度进行测定。结果表明添加Ag的养鸡场土壤中优势菌属为Dyella、Microscillaceae bacterium和Geothrix,Ag的粒径大小影响养鸡场土壤中微生物菌群结构多样性。粒径越小的Ag可能越容易诱导土壤中的优势菌属生长和int I1基因丰度增加,从而促进ARGs的传播;在粒径相近时,表面带正电荷的Ag比表面带负电荷的Ag更容易诱导int I1基因丰度增加,从而促进ARGs的传播;(3)研究不同粒径和表面电荷的Ag对p UC19质粒介导的ARGs在模式细菌中转化的影响。感受态大肠杆菌DH5α(Escherichia coli DH5α,E.coli DH5α)为受体细胞,质粒选择携带有氨苄抗性基因(Amp R)的p UC19质粒。将感受态E.coli DH5α和p UC19质粒暴露在环境相关浓度的不同性质Ag后共培养,发现四种Ag都可以促进ARGs的转化,促进转化程度依次为:Ag-1->Ag-2->Ag-3-;Ag-2+>Ag-2-。结果表明小粒径的Ag促进ARGs转化的潜在机制为:诱导ROS过量生成,导致细胞膜通透性增加,引起氧化应激,从而促进ARGs转化。表面带正电荷的Ag促进ARGs转化的潜在机制为:诱导ROS过量生成,导致细胞膜通透性增加,引起氧化应激,还可能负载吸附质粒DNA,运送质粒进入细菌细胞,从而促进ARGs转化。
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