蛋白激酶Cθ(Protein Kinase Cθ,PKCθ),一种钙离子非依赖性的新型PKC,在T细胞受体(T cell receptor,TCR)介导的成熟T细胞激活中起关键作用。在T细胞活化时,PKCθ被招募并定位到免疫突触与各种信号分子相互作用,传递TCR信号,激活转录因子NF-κB,AP-1和NFAT,诱导IL-2的产生。SUMO化修饰是一种可逆的、极瞬时的蛋白质翻译后修饰,在调节靶蛋白功能方面具有重要作用。为了深入探讨PKCθ在TCR受体信号通路中的调节机制,我们研究了PKCθ是否可以发生SUMO化修饰,以及SUMO化修饰对PKCθ功能的调节及机制。　　 本研究首先应用UFDS系统(Ubc9 fusion-directed SUMOylation system),通过免疫共沉淀和Wesern技术,发现Ubc9-PKCθ可以发生SUMO化修饰；接着利用生物信息学软件预测了PKCθ可能发生SUMO化修饰的位点,并通过对PKCθ进行将Lys突变成Arg的单点或多点KR突变,证明可能发生SUMO化修饰的关键位点是Lys325和Lys506。　　 为了验证在UFDS系统得到的结果是否具有生理意义,我们构建了PKCθ及其KR突变体的Flag或cMyc融合表达载体,通过在Jurkat T细胞中与SUMO1共表达,结果表明在没有外源Ubc9时,PKCθ可以发生SUMO化修饰,K325和K506是关键的两个SUMO化位点。在TCP/CD28共刺激Jurkat T细胞后,免疫沉淀内源PKCθ,Wegern检测其SUMO化修饰,发现PKCθ可以发生瞬时的单个SUMO化修饰。这些结果表明PKCθ的SUMO化修饰是生理性存在的。　　 蛋白分子序列上的保守性意味着功能上的重要性。我们比较分析了PKCOK325、K506在不同PKC亚型和不同物种间nPKC中的保守性,发现K325为PKCθ所特有,而K506从文昌鱼到人的各种PKC中非常保守；我们进一步通过实验证实斑马鱼的PKCθ同样发生SUMO化修饰。推测PKC发生SUMO化修饰具有重要的生理意义。　　 为了进一步研究PKCθSUMO化修饰的生理功能和分子机制,我们应用免疫荧光染色及亚细胞组份分离技术,比较分析了PKCθ以及PKCθKR突变体的细胞膜转位和在免疫突触的聚集程度,发现SUMO化修饰与否并不影响PKCθ的细胞膜、脂筏和免疫突触转位,但是缺失SUMO化修饰的PKCθ较弥散的分布在免疫突触上,不能有效地聚集到中央免疫突触。借助报告基因研究方法,分析了PKCθ的SUMO化修饰是否影响TCR/CD28诱导的NF-κB,AP-1和NFAT转录活性,发现若PKCθ缺失SUMO化修饰,将降低NF-κB,AP-1和NFAT的转录活性,其中PKCθK506R抑制作用更为显著。　　 我们利用RNA干扰技术构建了SUMO-/-细胞株,借助磷酸化抗体比较了Jurkat和SUMO-/-细胞株中,TCR/CD28激活PKCθ从而产生自身磷酸化的不同。结果表明缺失SUMO化修饰会减弱PKCθ的自磷酸化,提示PKCθ的彻底激活需要SUMO化修饰。我们还检测了PKCθ和PKCθ-K325/506R对TCR/CD28激活MAPKs的影响,发现JNK、P38和AKT的磷酸化没有显著差异,但ERK磷酸化的持续时间会有所差异:Jurkat T细胞中,过表达PKCθ-K325/506R时ERK磷酸化的持续时间不如过表达PKCθ时长。　　 本研究首次发现PKCθ能被SUMO化修饰,并鉴定了SUMO1修饰PKCθ的具体位点；发现PKCθ在免疫突触的有效聚集需要SUMO化修饰,TCPUCD28诱导激活NF-κB,AP-1和NFAT同样需要PKCθ的SUMO化修饰；发现缺失SUMO化修饰会减弱PKCθ的自磷酸化,PKCθ-K325/506R缩短ERK磷酸化持续时间,表明SUMO化修饰可能是通过调节PKCθ的激酶活性进而调节其功能。因此,本研究首次发现并证明了TCR诱导PKCθ发生SUMO化修饰及其对PKCθ功能和T细胞活化的重要性。