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研究背景:膀胱癌作为泌尿系统常见的恶性肿瘤,按照肿瘤侵袭范围可分为肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌。治疗方式主要以手术切除为主,辅以放、化疗。然而,由于膀胱癌术后的复发、化疗耐药等问题,往往造成不良的预后结局。其中遗传和环境因素是公认的致癌因素,比如年龄、吸烟和工业化合物制品等。其中,吸烟是被认为对膀胱癌的最为重要的独立危险因素。上皮—间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞获取间质特性的一种过程,在肿瘤发生、发展中起到重要作用。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)是一种具有多向分化潜能的,往往处于一种静止状态的肿瘤起始细胞,主要特点包括:耐药抵抗、自我更新、克隆成球、多向分化和高效致瘤性等。目前,研究表明癌症耐药的获得与肿瘤干细胞密切相关。CSCs与EMT之间具有很大的联系,EMT过程中可以促进CSCs的表达,CSCs也能表现出EMT行为。已有大量研究表明,吸烟促进膀胱癌增殖及EMT,吸烟对于肿瘤干细胞的促进作用在胰腺癌、口腔癌等也有研究证实。研究目的:吸烟对于膀胱CSCs的影响未见有报道,本次研究的主要目的是探究吸烟对于膀胱CSCs的干性及EMT的研究。研究方法:我们通过无血清悬浮培养法(Serum-free medium,SFM)对于膀胱肿瘤细胞EJ和UM-UC-3进行悬浮成球培养,所获得的成球细胞具有干细胞特性,高表达膀胱CSCs标志物(CD44,CD133,Oct4,ALDH1A1,Nanog)。并利用流式细胞仪检测成球细胞中CD44阳性细胞数的含量以及各细胞周期情况。根据之前的文献方法,我们建立了体外吸烟模型,获取了香烟烟雾混悬液(Cigarette smoke extract,CSE)。然后我们利用不同浓度的CSE处理膀胱肿瘤干细胞,检测处理后的干细胞标志物表达情况、CD44阳性细胞含量、EMT标志物表达情况和细胞增殖情况等。同时,我们检测Sonic Hedgehog信号通路在此过程中的表达情况,并利用Sonic Hedgehog信号通路的特异性抑制剂Vismodegib和Gli1-si RNA来进一步验证Sonic Hedgehog信号通路的作用。最后,我们检测膀胱CSCs和Sonic Hedgehog信号通路相关蛋白在吸烟和非吸烟膀胱癌组织标本中的表达情况。实验结果:经过SFM培养后,膀胱UM-UC-3和EJ悬浮细胞球形成,并高表达膀胱CSCs标志物(CD44,CD133,Oct4,ALDH1A1,Nanog)。流式细胞仪检测CD44阳细胞数明显增加,同时细胞周期结果提示悬浮细胞球大部分处于G1期,少数处于S期,这些结果符合干细胞的特点,说明了悬浮细胞球具备干细胞特性。然后我们用筛选出的不同香烟浓度来处理膀胱CSCs,结果提示吸烟处理后的膀胱CSCs标志物升高,悬浮细胞球变多、变大,CD44阳性细胞数明显增加,细胞增殖相关蛋白表达升高,Transwell实验提示成球细胞侵袭能力增加,上皮相关标记物E-cadherin和ZO-1蛋白表达下降,间质相关标记物N-cadherin和Vimnetin蛋白表达水平增加。这些结果说明吸烟促进膀胱CSCs的干性和EMT。为了进一步探究其中的机制,我们检测了Sonic Hedgehog(Shh)信号通路的表达情况,发现Shh通路相关蛋白Shh,Smo,Gli1和Gli2蛋白水平表达升高,利用Shh信号通路特异性抑制剂Vismodegib和Gli1-si RNA来抑制Shh信号通路后发现其逆转了吸烟对膀胱CSCs的效应。以上结果说明了Shh信号通路介导了吸烟对膀胱CSCs的作用,为吸烟相关膀胱癌的发病机理及潜在治疗措施提供了新的依据。此外,我们在吸烟与非吸烟标本上进行q RT-PCR、Western blotting和免疫组化分析也发现在吸烟膀胱癌患者标本中,膀胱CSCs标志物和Shh信号通路相关蛋白表达较非吸烟患者高。结论:吸烟通过Shh信号通路促进膀胱CSCs干性表达及EMT,从而在吸烟诱导膀胱癌的发病机制中提出新的思路,有利于提供干预膀胱CSCs的新的依据。