【摘 要】
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卤代氨基酸是合成多种药品、农用化学品等功能化学品的重要砌块。Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸（αKG）依赖型卤化酶是催化非芳香族氨基酸卤化的关键酶,然而目前报道的该类酶很少,且存在活性低、底物谱窄等问题。通过新酶挖掘与酶的分子改造,有望获得新型Fe（Ⅱ）/αKG依赖型氨基酸卤化酶,并改善其催化性能。Fe（Ⅱ）/αKG依赖型氨基酸羟化酶与氨基酸卤化酶同属于Fe（Ⅱ）/αKG依赖型加氧酶家族,通过酶分子改造有
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卤代氨基酸是合成多种药品、农用化学品等功能化学品的重要砌块。Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸（αKG）依赖型卤化酶是催化非芳香族氨基酸卤化的关键酶,然而目前报道的该类酶很少,且存在活性低、底物谱窄等问题。通过新酶挖掘与酶的分子改造,有望获得新型Fe（Ⅱ）/αKG依赖型氨基酸卤化酶,并改善其催化性能。Fe（Ⅱ）/αKG依赖型氨基酸羟化酶与氨基酸卤化酶同属于Fe（Ⅱ）/αKG依赖型加氧酶家族,通过酶分子改造有望将该类氨基酸羟化酶改造成卤化酶。因此,本研究对Fe（Ⅱ）/αKG依赖型反式-脯氨酸-4-羟化酶Da P4H进行分子改造,设计并克隆了五个点突变体,其中突变体D111G和F209L对L-脯氨酸显示明显催化活性,其产物结构有待进一步鉴定。为发掘新型Fe（Ⅱ）/αKG依赖型氨基酸卤化酶,本研究通过基因挖掘和序列相似网络分析,预测并合成了六个候选氨基酸卤化酶基因。将含有酶基因的质粒分别转入到大肠杆菌,进行酶的异源表达和纯化。使用纯酶催化氨基酸底物,高效液相色谱分析显示Ca Hal、Ak Hal和AtHal对L-赖氨酸具有明显活性（活性大小:Ak Hal＞AtHal＞Ca Hal）。由于AtHal具有较高热稳定性与较好新颖性（与已报道Bes D的序列一致性53%）,本研究选择AtHal进行分子改造研究。该工作分为两部分:一是通过使用序列保守性分析、相似氨基酸扫描和loop置换三种策略,以期提高AtHal对赖氨酸的活性;二是通过loop置换和点突变,以期拓宽AtHal的底物谱。通过测定纯酶催化L-赖氨酸的动力学参数,显示四个AtHal突变体的催化效率比野生型高,其中AtHal-HA突变体的kcat/KM（34.50±1.00）是野生型（7.09±0.61）的4.8倍,H160A的kcat/KM（16.90±0.92）是野生型的2.4倍,T247S的kcat/KM（10.03±0.77）是野生型的1.4倍,以及AtHal-HA/T19的kcat/KM（9.36±1.31）是野生型的1.3倍。另一方面,通过酶耦联法筛选AtHal突变体对亮氨酸、鸟氨酸的活性,发现突变体AtHal-LEU对亮氨酸有活性,突变体e6、e5、g5对鸟氨酸有活性（活性大小:e6＞e5＞g5）,但总体活性较低。本研究鉴定了影响Fe（Ⅱ）/αKG依赖型氨基酸卤化酶AtHal催化性能的关键位点和区域,为该类酶的进一步分子改造提供了重要指导。
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