肉毒毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）是由肉毒梭状芽孢杆菌产生的一种蛋白类神经毒素,通过阻断神经-肌肉突触的传递进而引发松弛性的肌肉麻痹导致个体中毒。肉毒毒素可分为7种血清型（A-G）,其中A、B、E和F型能引起人类肉毒中毒,A型毒性最强且最为常见。按肉毒毒素的“双受体学说”,BoNT/A有两种受体—小分子神经节苷脂GT1b和突触囊泡蛋白SV2C。目前关于BoNT/A与这两个受体的结合位点已经明确。2013年Brigitte等研究发现成纤维生长因子受体3（Fibroblast Growth Factor Receptor 3,FGFR3）是BoNT/A新近发现的受体,其与毒素结合后会引发毒素内吞,但关于该受体与BoNT/A结合的确切位点以及在肉毒中毒中所起的作用以及与其它两种受体间的相互关系尚不清楚。本课题通过截短、肽库分析、分子对接、序列比对、构建突变体及动物实验等手段研究了受体FGFR3在BoNT/A上的结合位点、不同亚型BoNT/A毒力差异的原因以及3种受体（GT1b、SV2C、FGFR3）之间的关系,从而为阐明肉毒中毒机制、肉毒毒素疫苗及中和抗体研发奠定理论基础。分别表达纯化了受体FGFR3与受体结合区BoNT/A重链C端（BoNT/AHc）并制备了供空间结构解析的复合物晶体;表达纯化了截短片段BoNT/A H_CN和H_CC,通过间接酶联免疫吸附测定方法（ELISA）确定FGFR3与BoNT/A结合位点位于H_CN区。合成了由46条15肽组成的BoNT/A H_CN肽库,通过间接ELISA分析发现第20、21、37号小肽与FGFR3结合能力较强,其中37号小肽结合能力最强。通过The PyMOL Molecular Graphics System软件对这3个肽的空间位置分析发现20、21、37号小肽在空间上临近并形成一个凹面。基于肽库筛选结果利用分子对接软件Discovery Studio对BoNT/A与受体FGFR3可能的结合位点进行预测,得到2个经验函数评分较高的模型Pose14、Pose155,分别选用Pose14中的1061R与Pose155中的970N进行突变验证,结果显示模型Pose14个更为可靠,推测FGFR3与配体BoNT/AH_C上的Ser902、Thr963、Asn966、Asn971、Glu982、Gln988、Asp1058、Gly1059、Arg1061氨基酸残基有直接相互作用。对BoNT/A不同亚型毒力差异的原因进行了探究。研究了不同亚型BoNT/A的毒力差异与结构的关系。BoNT/A1、BoNT/A2和BoNT/A4通过动物分析法测定了3种毒素的毒力,证实3种亚型毒素毒力强度顺序为A1>A2>A4。通过氨基酸序列比对,发现A1与A4的L_C与H_C结构域的差异较大。表达纯化了A型毒素A4的轻链A4L,利用轻链内肽酶测活的方法对A1与A4轻链的活性进行比较,发现这两者间并无显著差异。通过构建A1、A4嵌合体的方式分析了A1与A4的H_C结构域的差异。嵌合体的小鼠生物测定实验表明含BoNT/A1Hc结构域的嵌合体具有活性。这说明A1、A4在H_C上存在差异,并且A1、A4氨基酸序列比对中H_C结构域上H_CN序列的差异比H_CC的差异大,而位于H_CN结构域上37号肽的序列也存在着明显差异。之前的实验预测37号小肽为受体FGFR3的结合区,推测BoNT/A不同亚型毒力差异的原因是不同亚型与受体FGFR3结合能力所致,待通过实验进一步验证。对BoNT/A的3个受体关系的研究,分别是从突变毒素上已知受体结合位点与抗体封闭蛋白受体两个角度出发。一方面将BoNT/A上的已知受体结合位点（GT1b/SV2C）分别突变,毒素的活性均下降了3个数量级,提示受体GT1b和SV2C与毒力相关;另一方面我们制备了蛋白受体SV2C和FGFR3的鼠单抗,小鼠活性实验中用抗体单独封闭受体SV2C/FGFR3后,BoNT/A的两种受体的单抗对毒素具有一定的中和作用,提示了受体SV2C和FGFR3与毒力相关。另外发现同时封闭受体SV2C与FGFR3后,毒力下降的程度,中和作用未显示增强;细胞活性实验中,通过抗体单独封闭受体SV2C/FGFR3后,结果并未检测到毒素的酶切产物SNAP25₁₉₇,这与动物活性实验的结果相一致,说明3个受体均与毒力相关,对于三个受体间的相互关系还有待进一步研究。