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研究目的:桂皮醛(Cinnamaldehyde,CA),是中药肉桂挥发油中的一种主要提取物。本课题组前期体外实验研究发现:CA对多株肿瘤细胞具有诱导凋亡和抑制侵袭转移的功效,而其中的作用机制尚未明确阐明。此外,结合理论和前期研究我们发现,上皮间质转化可能是肿瘤发生发展和侵袭转移机制之一。因此本课题组拟研究桂皮醛对人非小细胞肺癌细胞凋亡和上皮间质转化的影响,进一步探讨CA抑制非小细胞肺癌的可能机制,为中医药治疗肺癌提供新的理论依据。研究方法:1采用MTT法,观察CA对非小细胞肺癌细胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299的增殖抑制作用。2采用流式细胞术(Flowcytometry,FCM)和Hoechst 33258染色实验,研究CA对A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞凋亡比例和染色质形态的影响。3采用CoCl2构建缺氧模型,倒置相差显微镜观察细胞形态变化。4采用划痕实验检测细胞迁移能力的变化。5采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。6 采用 RT-qPCR 法检测 CA 对 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 细胞中凋亡、EMT、侵袭转移及Wnt/β-catenin通路相关基因表达的影响。7 采用 Western blotting 实验检测 CA 对 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 细胞中凋亡、EMT、侵袭转移及Wnt/β-catenin通路蛋白表达的影响。8采用免疫荧光实验检测CA对A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞中β-catenin胞浆聚集及核转位表达的影响。9采用人肺腺癌细胞A549建立裸鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射给药,测量并计算CA对移植瘤体积和质量的抑制率。10采用RT-qPCR、Western blotting、免疫组织化学方法检测移植瘤组织中Wnt/β-catenin通路活性及凋亡、EMT、侵袭转移相关蛋白的变化。研究结果:1 MTT实验提示,CA能有效抑制非小细胞肺癌细胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299增殖,并呈现剂量、时间依赖性。2流式细胞术结果提示CA能诱导A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞凋亡且与浓度呈正相关。Hoechst33258荧光染色实验观察到CA使得细胞核出现核固缩及碎裂。3 RT-qPCR 实验结果显示,CA 作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 细胞后,Bcl-2、Bcl-xl基因表达下降,Bax基因表达上升。Western blotting实验结果显示,CA作用于A549细胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3、PARP 蛋白表达下降,Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达上升。4 CoCl2作用于A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞后,细胞呈现出纺锤状间质形态。划痕实验、Transwell小室侵袭实验检测出CoCl2诱导的缺氧环境可显著增强细胞的迁移、侵袭能力。5 RT-qPCR 实验结果显示,CoCl2 作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 细胞后,N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、MMP-2、MMP-9、MMP-14 基因表达上升,E-cadherin基因表达下降。Western blotting实验结果显示,CoCl2作用于细胞后,HIF-1α、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9 蛋白表达增强,E-cadherin 蛋白表达减弱。6 CA作用于CoCl2诱导的A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞后,划痕实验、Transwell小室侵袭实验结果显示CA能够有效降低CoCl2诱导的细胞迁移、侵袭能力。RT-qPCR及Western blotting实验结果显示,CA显著抑制了 CoCl2诱导的细胞MMPs表达及EMT。7 RT-qPCR 及 Western blotting 实验结果显示,CoCl2 能够显著增强 A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞中β-catenin、Cyclin-D1表达并促进β-catenin核聚集,而CA能有效地抑制Wnt/β-catenin通路相关基因活性。免疫荧光实验结果显示CoCl2诱导了β-catenin的胞浆聚集与核转移,而该促进作用可被CA有效抑制。8 特异性激动剂LiCl作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 细胞后,Wnt/β-catenin通路活性随之被激活,同时细胞迁移、侵袭能力增强,且Western blotting实验证实Wnt/β-catenin通路的激活可诱导细胞发生EMT。相反,特异性抑制剂XAV939作用于CoCl2诱导的A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞后,Wnt/β-catenin通路活性降低的同时,细胞迁移、侵袭能力减弱,细胞EMT被逆转。此外,Western blotting实验结果显示,CA能逆转A549,YTMLC-90,NCI-H1299细胞EMT且效力较XAV939相似,而LiCl在激活了Wnt/β-catenin通路的同时,能够部分逆转CA对细胞EMT的抑制作用。9体内裸鼠移植瘤模型中,CA应用后肿瘤的瘤体积较空白组明显减小,肿瘤的质量与空白组比较也有所下降,低、高剂量组的肿瘤生长均受到抑制。10 RT-qPCR及Western blotting实验证实,裸鼠移植瘤经CA腹腔注射后,肿瘤组织中促凋亡基因表达上调,抑凋亡基因表达下调;间质样分子表达被抑制;Wnt/β-catenin活性亦减弱,且均呈明显的剂量依赖性。免疫组织化学法检测结果显示,随着CA浓度提高,肿瘤组织中Cleaved PARP、E-cadherin表达递增,β-catenin表达则随之递减。研究结论:1桂皮醛能有效抑制人非小细胞肺癌细胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299增殖并通过增加Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、PARP诱导细胞发生凋亡。2桂皮醛能抑制人非小细胞肺癌细胞上皮间质转化进而起到抗侵袭转移的功效。3桂皮醛能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,逆转人非小细胞肺癌细胞上皮间质转化。